cycle基因对噻嗪酮、噻虫嗪防治白背飞虱效果影响探索研究

康 奎,张 杰,万思景,龚 俊,张道伟

(遵义师范学院生物与农业科技学院/贵州省赤水河流域动物资源保护与应用研究重点实验室,遵义 563002)

白背飞虱Sogatellafurcifera属半翅目飞虱科,是危害水稻且所涉范围较大的迁飞性害虫之一,同时也是我国和东南亚水稻产区的主要害虫之一。白背飞虱的成虫和若虫经常群集于水稻丛的下部刺吸水稻汁液,或雌虫用产卵器刺破叶鞘和叶片(金剑雪, 2011),白背飞虱也能够进行病毒的传播,如南方水稻黑条矮缩病毒(刘丹凤, 2016)。长期以来,对于白背飞虱的防治手段都是利用化学药物来进行防治,但是长时间的使用化学农药,不仅会导致害虫产生一定的抗药性,而且对于环境也有着严重的破坏和污染。

化学杀虫剂的应用通常被认为是一种廉价和容易获得的抑制害虫数量的方法,在过去的50年里,它一直是害虫防治的主要形式(Liangetal., 2015)。现在大部分的研究都偏向寻找适合的生物药剂来进行防治白背飞虱,但由于其应用成本较高且防治效果比化学药剂见效慢,所以目前大部分的地区依旧使用的是化学农药(汪勇等, 2017)。在我国对于农药的使用有较为严重的浪费现象并且农药的有效利用率很低,仅为20%,所浪费的农药会对环境造成一定的破坏和污染(屠豫钦等, 2003)。为了降低对生态环境的危害,农药的高效利用就显得尤为重要,如何高效的使用农药,降低环境污染及白背飞虱产生抗药性的速率仍然是一项长期研究目标。研究表明,杀虫剂氯氰菊酯在斜纹夜蛾3龄幼虫中暴露于3种不同光周期的毒性有不同的结果,在不同的时间,不同的光周期,谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性发生了显着变化。在此期间,特定的解毒酶的活性会波动,对于特定的杀虫剂,导致50%死亡率的浓度在不同的光周期中会发生显着变化(Karthi and Shivakumar, 2016)。

生物钟是生物体生命活动的内在节律性,它会影响着动物许多的生理活动和行为,能够表现出一定的节律性,动物中存在着许多的节律基因。昼夜节律所产生的每日节律能够调节许多的生命功能,在果蝇中也证明了昼夜节律系统在调节异种生物毒性方面具有保守作用(Michelleetal., 2010)。根据研究果蝇突变体发现,clock基因能在脂肪体中影响淀粉向蛋白质转变的过程,从而使昆虫更具有饥饿感,进一步影响到昆虫的取食行为(Chatterjeeetal., 2010),在果蝇的味觉器官中cycle和period基因也通过影响味觉受体神经元的表达来影响它的取食行为(Xuetal., 2008)。在褐飞虱Nilaparvatalugens中干涉Nlcycle节律基因能够影响其对吡虫啉农药的抗性(Kangetal., 2017)。在沙漠蝗虫Schistocercagregaria中,利用RNAi的方法也发现period和timeless基因不仅能够影响雄虫精子的运输与释放,还能够影响雌虫卵巢内卵的发育(Tobbacketal., 2011; Tobbacketal., 2012)。

本研究拟结合昆虫生物节律,在一天不同时间点探索噻虫嗪、噻嗪酮对白背飞虱的防治效率,并利用RNAi方法探索白背飞虱节律基因Sfcycle在两种农药防控中的作用,研究结果可为农药的高效使用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用白背飞虱来采自于遵义市,昆虫饲养温室中混合饲养,饲养温室温度为28±1℃,相对湿度为80%±10%,光周期为L∶D=16 h∶8 h。噻虫嗪(30%悬浮剂)购至山东华阳农药化工集团有限公司,噻嗪酮(50%悬浮剂)购至上海悦联生物科技有限公司,配置溶剂为水。

1.2 农药室内致死效率检测

配制田间推荐使用的浓度为0.27 g/L噻虫嗪、5 mL/L噻嗪酮,利用稻茎浸渍法(宋江波, 2017),将准备好的水稻茎在0.27 g/L噻虫嗪或5 mL/L噻嗪酮药液中浸渍30 s,晾干,用棉花包住水稻根部使其处于湿润状态,置于培养管中。将成虫第1天的白背飞虱用吸虫器移入培养管中,每个培养管放置20头试虫,管口处用纱布罩住,每个时间点3个重复组,以水处理为对照。处理组及对照组都置于相同条件下的昆虫饲养温室中观察,每隔3 h统计死亡率,统计12 h。采用校正死亡率计算,公式如下:

校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100

1.3 白背飞虱Sfcycle序列的克隆

在网上数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)上搜索昆虫cycle基因,选择褐飞虱、果蝇、蚜虫等与白背飞虱相近或模式昆虫物种,利用本地Blast在白背飞虱转录组数据中查找序列。设计全长引物克隆并测序后,在NCBI进行Blastx验证克隆序列,获得其部分序列。设计引物见表1。

表1 本实验所用引物

1.4 节律基因Sfcycle的RNA干涉

根据扩增得到的序列,避开定量区域,设计dsRNA引物(见表1)。dsRNA合成使用Promega T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒进行。所合成的dsRNA分别进行凝胶电泳检测其完整性和微量核酸蛋白测定仪测定其浓度。按照Kang等方法进行RNA干涉,注射量为150 ng/头,注射同等量的dsGFP作为对照。注射后将白背飞虱放于新鲜水稻上,并放回温室继续饲养,在干涉24 h、48 h、72 h后取样,每管3头,共取9管,检测其干涉效率。同一批注射的白背飞虱使用1.2方法进行农药致死效率检测。

1.5 定量PCR检测

白背飞虱虫体或组织样品总RNA的提取采用Trizol试剂(Invitrogen公司)。将所提取的总RNA用凝胶成像系统分析其完整性,RNA浓度的测定在NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪上进行,并通过OD260/OD280验证纯度。然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)将1 μg Total RNA反转录成cDNA。

使用PCR多孔板按下列组分配置定量PCR反应体系(10 μL反应体系):SYBR premix Ex Taq,5 μL;cDNA模板,1 μL;PCR Forward Primer(F),0.2 μL;PCR Reverse Primer(R),0.2 μL;ddH2O,3.6 μL;共10 μL。每个处理进行3次生物学重复,引物序列如表1所示,q-PCR反应程序如下:95℃预变性10 s;95℃变性5 s;58℃退火15 s;72℃延伸20 s;共40个循环。使用β-Actin基因作为内参。数据使用2-ΔΔCt法进行运算,用白背飞虱注射dsGFP组的Ct值为对照组。

1.6 数据分析

用Excel软件对数据进行整理,并使用SPSS 17.0软件对所统计的具体数据进行统计分析,使用One-Way ANOVA法进行差异显著性检验(P<0.05为差异显著,用*表示;P<0.01为差异极显著,用**表示),数据表示为平均值±标准误。处理后的数据采用GraphPad Prism 6软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同时间点白背飞虱对两种农药的敏感性检测

利用0.27 g/L噻虫嗪、5 ml/L噻嗪酮处理白背飞虱在72 h内的死亡率如图1。噻虫嗪、噻嗪酮处理的白背飞虱统计至72 h时,在7∶00时校正死亡率均较低,分别为54%、13.9%,16∶00时校正死亡率均较高,分别为89.8%、44.9%。

图1 0.27 g/L噻虫嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同时间点对白背飞虱的致死率检测Fig.1 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points注:数据为平均值±标准误,不同字母表示差异显著(P<0.05,t检验)。Note: Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, t-test).

2.2 白背飞虱节律基因Sfcycle的克隆及表达分析

通过对Sfcycle基因的克隆获得其全长为5 042 bp。荧光定量PCR检测结果显示Sfcycle基因在各组织中均有表达,且发现其在卵巢中的表达量最低,中肠表达量最高。4龄和5龄若虫期在蜕皮前Sfcycle表达量较之蜕皮后高,成虫期表达量相对稳定(图2)。

图2 Sfcycle基因在不同组织和发育龄期中的表达量Fig.2 Relative mRNA expression of Sfcycle in different tissues of one-day-old brachypterous females and different development stage注:Ov, 卵巢; Mg, 中肠; Ep, 表皮; Fb, 脂肪体; He, 头。数据为平均值±标准误,不同字母表示差异显著(P<0.05, Tukey’s 检验)。Note: Ov, Ovary; Mg, Midgut; Ep, Epidermis; Fb, Fat body; He, Head. Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, Tukey’s test).

2.3 Sfcycle基因干涉效果检测

与注射dsGFP相比在注射了150 ng的dsSfcycle后,SfcyclemRNA的相对表达水平在3个检测时间点与dsGFP相比均有显著性下调(图3-A)。干涉24 h后分别在7∶00和16∶00检测SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2的基因表达量,结果发现与对照相比,2个P450基因的表达量在2个检测时间点均显著降低。

图3 白背飞虱节律基因Sfcycle干涉效率(A)及其对P450基因的影响(B, C)Fig.3 Efficiency of RNA interference (A) and affects of the expression levels of P450 genes (B, C)注:数据为平均值±标准误,柱上星号表示差异极显著(P<0.01, t检验)。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (P<0.01, t-test).

2.4 干涉后噻虫嗪、噻嗪酮在一天不同时间处理白背飞虱后死亡率统计情况

为了更好的验证节律基因是否影响白背飞虱对噻虫嗪、噻嗪酮的耐性,利用RNAi方法处理白背飞虱,并分别在7∶00和16∶00利用噻虫嗪、噻嗪酮处理白背飞虱。在干涉节律基因后,利用噻虫嗪、噻嗪酮处理白背飞虱的死亡率并没有显著差异,对照组注射了dsGFP之后的两个时间点仍有显著差异。这表明Sfcycle基因的表达量影响着白背飞虱对噻虫嗪、噻嗪酮的耐性,即影响了噻虫嗪、噻嗪酮对白背飞虱的防治效果(图4)。

图4 干涉Sfcycle后0.27 g/L噻虫嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同时间点对白背飞虱的致死率检测Fig.4 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points injection of dsGFP and dsSfcycle注:数据为平均值±标准误,柱上星号表示差异显著(*P<0.05,**P<0.01,t检验),ns表示没有显著性差异。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (*P<0.05, **P<0.01, t-test). ns indicated no significant difference.

3 结论与讨论

生物钟存在于所有的生物体中,包括细菌、植物和动物。迄今,已经有多个时钟基因以及时钟相关基因被鉴定,这一些时钟基因会和它们的相应产物组成两个互相依赖的转录/翻译反馈环路,从而来调节行为和生理的昼夜节律(周先举等, 2005)。生物的节律也会受到光和温度的影响,在24 h之内会呈现有规律的变化,它们通常在不同的组织中会有不同的下游基因来调控组织内基因的节律(Cerianietal., 2002)。据报道,杀虫剂,如有机磷和有机氯等,对各种害虫昆虫的作用也会随着一天中不同的时间而变化(Hoovenetal., 2009)。如,埃及伊蚊Aedesaegypti和家蚕Bombyxmori在同一天的不同时间内对绿菊酯的抗性不同(Yangetal., 2010),褐飞虱在ZT20和ZT16这两个时间点对吡虫啉的抗性也不同(Kangetal., 2017),本研究也发现,两种不同农药在一天不同时间内对白背飞虱的致死效率也有显著性的差异。

抗性代谢相关的酶的表达具有一定的节律现象,这在多个昆虫中均有报道。例如,许多已经确定或即将确定功能的基因如细胞色素P450蛋白,细胞色素P450氧化还原伴侣,酯酶,谷胱甘肽-s转移酶。据报道,尿苷5′-二磷酸葡萄糖基转移酶(GSTs)或尿苷5′ -二磷酸葡萄糖基转移酶有节律地表达(Claridge-Changetal., 2001; McDonald and Rosbash, 2001; Cerianietal., 2002; Linetal., 2002; Uedaetal., 2002)。在果蝇中至少有5个与农药代谢相关P450基因CYP4E2、CYP6A2、CYP6G1、CYP6W1、CYP12A4的表达具有节律(Hoovenetal., 2009),褐飞虱的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6AX1等(Kangetal., 2017)。在冈比亚按蚊Anophelesgambiae中,通过组学的测定发现至少有2 000以上的基因具有节律性表达,而这其中就包括了与拟除虫菊酯和DDT代谢能力相关基因,包括CYP6M2、CYP6P3、CYP6Z1和GSTE2,这些基因的表达最高值在一天不同的时间,都是受节律调控的(Balmertetal., 2014)。杀虫剂氯氰菊酯在斜纹夜蛾Spodopteralitura3龄幼虫中暴露于3种不同光周期的毒性有不同的结果,在不同的时间、不同的光周期,谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性发生了显着变化(Wangetal., 2020)。褐飞虱体内节律基因Nlcycle的表达情况影响了其抗药性基因的表达,最终表现出其对农药吡虫啉的抗性降低(Kangetal., 2017)。本研究在降低了Sfcycle基因表达后,显著影响了参与白背飞虱对杀虫剂响应的2个细胞色素P450基因SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2(贾泽艳等, 2020)的表达,通过对其进行农药浸染的水稻处理后,白背飞虱的死亡率显著性的增加。

由于在农药方面存在高度的适应性,导致就算使用特效的化学农药也不能够实现稻飞虱可持续治理的目标(Pangetal., 2015)。本试验将白背飞虱在一天之内对噻虫嗪、噻嗪酮的敏感性做了分析,以求达到高效率的使用化学农药防治,实验结果可以用来改善农药的使用和提高田间农药使用效率。