非洲猪瘟病毒数字PCR检测方法的建立及比较

赵晓娜，谭笑，朱忠武，周萍，祝贺，陆冠亚，史敏，沈炜，唐泰山*，祝长青，孔繁德

(1. 南京海关，江苏 南京 210019；2. 长沙海关，湖南 长沙 410004；3. 南京晓庄学院，江苏 南京 211171；4. 厦门海关，福建 厦门 361013)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪急性接触性传染病，以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，其感染导致的发病率和死亡率可高达100%，对生猪养殖行业危害极大[1]。ASF是世界动物卫生组织(WOAH)法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

目前，ASFV实验室检测方法主要有血清学和分子生物学方法。血清学方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、直接荧光试验(FAT)和间接免疫荧光试验(IFA)等[2]，分子生物学方法主要为PCR、荧光PCR、数字PCR等[3]。PCR技术简单方便，但是灵敏度不够。荧光PCR技术更为灵敏，但常遇到样品病毒含量低，Ct值较大而不能确认检测结果的情况。数字PCR(ddPCR)技术，作为一种核酸检测绝对定量的新技术，与荧光PCR相比，具有可检测痕量病毒样品、灵敏度高、特异性强的优点[4]。目前，该技术已经在医学诊断、病原体检测、食品安全等越来越多的领域得到应用[5-7]。

本研究在之前建立的荧光PCR方法基础上，建立和优化了可用于定量检测ASFV的数字PCR方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)毒株由本课题组保存；猪水泡病病毒(SVDV)核酸由广州千寻生物公司生产；ASFV阳性猪肉样品核酸由本课题组保存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物和探针的设计和筛选

从GenBank中下载74株ASFV的全基因序列，其中来自非洲21株，欧洲41株，亚洲12株，含11个基因型，其中基因Ⅰ型22株，基因Ⅱ型33株。用DNAStar软件进行同源性分析，选取同源性较高的CP2475L、B602L基因作为目的片段，用Primer Express 3.0软件设计3套数字PCR引物和探针C1、C2、B1，其中探针的5′ 端标记FAM，3′ 端标记BHQ1(表1)。所有引物与探针由南京金斯瑞公司合成。

表1 数字PCR引物和探针

1.2.2 荧光PCR扩增

选取不同来源的ASFV核酸8份作为模板进行荧光PCR扩增，荧光PCR反应体系为：qPCR Master Mix(Applied Biosystems)12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，TaqMan探针(20 μmol/L)0.125 μL，DNA模板5 μL，补水至25 μL。扩增程序为预变性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，扩增40个循环。筛选到C1用于下一步的试验。

1.2.3 荧光PCR特异性和灵敏度

制备ASFV、PRV和PCV-2的DNA，以及PRRSV、CSFV、SIV和SVDV的cDNA，制备家猪、野猪、牛、羊、鸡样品核酸作为动物组织背景，进行荧光PCR扩增，验证方法的特异性。

取ASFV核酸，用C2上游引物、C1下游引物进行PCR扩增，扩增目的片段大小为1 535 bp，是CP2475L基因的长片段，可用于2种引物的特异性和灵敏性检测。用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)对PCR产物进行纯化，测序比对确认序列的准确性。双链DNA用超微量分光光度计进行定量，计算拷贝数后进行10倍倍比稀释。取10倍倍比稀释的双链DNA进行荧光PCR扩增，测试方法的灵敏度。

1.2.4 数字PCR体系和反应条件

在C1荧光PCR方法的基础上建立数字PCR方法，其过程包括体系配置、微滴生成、PCR扩增、读取微滴。配置反应体系：2×Supermix for Probes(Bio Rad)10 μL，上、下游引物终浓度为0.9 μmol/L，探针终浓度为0.25 μmol/L，模板1 μL，补水至20 μL。转移20 μL反应液至微滴生成卡，在生成卡对应位置加入70 μL微滴生成油，在微滴生成仪中生成微滴。随后转移微滴至96孔PCR反应板，封膜后置于PCR仪中扩增，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，退火/延伸1 min，40个循环；98 ℃ 10 min。扩增结束后，用微滴读取仪(Bio-Rad，QX200)读取微滴荧光信号，在QuantaSoft Droplet Reader 软件(V1.7.4)中分析结果。

1.2.5 数字PCR特异性和灵敏度

取上述7种病毒核酸，5种动物组织核酸(同1.2.3)，进行数字PCR扩增，观察阳性微滴的分布及荧光信号强度，判断数字PCR方法的特异性。

取10倍倍比稀释后浓度范围为104～10-1copies/μL的双链DNA作为模板，每个浓度设立3个重复，测试方法的灵敏度，绘制标准曲线并进行线性分析。

1.2.6 空白检测线(LOB)与最低检测线(LOD)测定

参考美国临床实验室标准化委员会标准和测定指南(NCCLS EP17-A2)[8]，用数字PCR对6份阴性样品进行60次检测，测定数字PCR的LOB；对4份含低拷贝ASFV核酸的样品进行40次检测，每个反应中ASFV核酸含量为2～3 copies，测定数字PCR的LOD。

1.2.7 临床样品检测

收集50份不同来源的猪组织或含猪组织样品，分别用建立的数字PCR、C1荧光PCR方法及WOAH荧光PCR、WOAH常规PCR方法进行检测[9]，比较分析不同方法的检测结果。

2 结果

2.1 引物探针筛选

用设计的3套引物探针对不同来源样品的ASFV核酸进行荧光PCR扩增。荧光PCRCt值C2与C1相差1.1±0.6，B1与C1相差0.7±0.6，选择C1进行后续试验(表2)。

表2 3套引物探针初筛试验(n=8)

2.2 荧光PCR灵敏度和特异性

以PRV、PCV-2、ASFV基因组DNA，PRRSV、CSFV、SIV、SVDV的cDNA以及家猪、野猪、牛、羊、鸡基因组DNA作为模板，进行荧光PCR扩增，发现仅有ASFV出现特异性扩增曲线，其他均没有扩增曲线。

用C1体系扩增浓度为6×108～6×100copies/μL双链DNA，发现稀释到6 copies还能扩增出特异性曲线，其中浓度为6×108～6×100copies/μL扩增的Ct值依次为9.27、12.97、16.55、20.10、23.82、27.43、31.01、34.76、38.58，Ct值和双链DNA拷贝数的对数相关性方程为Y=-3.64X+40.99，R2=0.999(图1)，呈现良好的线性关系。

1～9. 分别为模板DNA的拷贝数6×108～6×100 copies/μL；10. 阴性对照。图1 C1荧光PCR的扩增曲线(A)和标准曲线(B)

2.3 数字PCR条件优化

设置3个引物探针浓度组，第1组为(0.65 +0.150)μmol/L，第2组为(0.9 +0.25)μmol/L，第3组为(1.2 +0.35)μmol/L，以相同浓度的双链DNA作为模板进行数字PCR。结果显示第2组和第3组的阳性微滴荧光值与本底之间的差值较大，第2组的阳性微滴产生数量最多，则最佳PCR引物和探针浓度分别为0.9 μmol/L和0.25 μmol/L。

以相同浓度的双链DNA作为模板，在55～62 ℃之间摸索数字PCR反应最佳退火温度，8组退火温度设定为55、55.5、56.5、57.8、59.4、60.7、61.6和62 ℃。结果显示，随着温度升高，阳性微滴荧光值不断降低，综合分析选择退火温度为60 ℃(图2)。

A01～H01. 依次为62、61.6、60.7、59.4、57.8、56.6、55.5和55 ℃。图2 退火温度优化结果

2.4 数字PCR特异性和线性分析

通过对7种病毒核酸和5种动物组织核酸进行的特异性试验，显示仅ASFV检测孔出现阳性微滴，PRV、PCV-2、PRRSV、CSFV、SIV、SVDV以及家猪、野猪、牛、羊、鸡均无阳性微滴(图3)，表明建立的数字PCR方法有很好的特异性。

A02～G03. 依次为PRV、PCV-2、PRRSV、CSFV、SIV、SVDV，家猪、野猪、牛、羊和鸡的组织；E03. ASFV。图3 数字PCR特异性试验

以倍比稀释的双链DNA作为模板进行数字PCR，结果显示线性回归系数R2=0.999，变异系数均小于3%，ASFV计算拷贝数与实际检测拷贝数呈现出很好的线性关系(图4，图5)，表明其具有较好的重复性(表3)。

B05、D05. 阴性对照；C06～C07. 1 copies·μL-1；B08～D08. 10 copies·μL-1；B09～D09. 1 00 copies·μL-1；B10～D10. 1 000 copies·μL-1。图4 数字PCR的线性分析结果

图5 数字PCR标准曲线

表3 ASFV ddPCR 重复性试验

2.5 LOB与LOD

以ASFV核酸作为阳性对照，60次阴性样本检测中基本无阳性微滴检出，根据NCCLS EP17-A指南，经统计分析可得数字PCR方法的LOB为1.6 copies/μL。为确定方法的LOD，分3次试验对4个低拷贝样品进行了40次检测。根据EP17-A的指南，统计分析得出数字PCR方法的LOD为3 copies/μL。临床检测中样品拷贝数低于1.6 copies/μL，即可判为阴性，高于3 copies/μL可判为阳性，介于两者之间，需要重新取样或者提高核酸浓度进行确认。

2.6 临床样品检测

提取50份不同来源的临床样品核酸，用建立的数字PCR、C1荧光PCR方法以及WOAH荧光PCR、WOAH常规PCR方法对样品进行检测。前3种方法均从样品中检出12份ASFV核酸，38份样品未检出ASFV核酸；WOAH常规PCR方法从样品中检出8份ASFV核酸(表4)。WOAH荧光PCR与C1荧光PCRCt值差值为2.2±1.9(n=12)。

表4 阳性样品不同检测方法比较

3 讨论

数字PCR是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术[10]，灵敏度高，可对核酸进行绝对定量，常用于病原体检测、动物源性成分检测、转基因检测等。在非洲猪瘟检测应用方面，邬旭龙等[11]针对K205R基因建立ASFV 数字PCR检测方法；原霖等[12]在WOAH荧光PCR方法的基础上建立数字PCR方法；严礼等[13]在WOAH荧光PCR方法、团体标准T/CVMA5—2018荧光PCR方法基础上建立数字PCR方法，并与邬旭龙等[11]建立的方法进行比较。

本研究基于74株ASFV病毒全基因组序列分析，选择CP2475L基因保守区段建立数字PCR方法。ASFV CP2475L基因位于基因组较为保守的C区，编码pp220蛋白，pp220相对分子量为281.5 kDa，属于病毒感染中的晚期蛋白，是构成病毒粒子核衣壳的主要成分[14]，目前未见以CP2475L基因作为靶基因的ASFV PCR检测方法。分析引物探针与74株ASFV基因序列同源性发现，共计4个位置碱基有错配的情况发生，WOAH荧光PCR引物探针有8个位置碱基发生错配，引物和探针结合区的错配可能会导致假阴性。2019年，越南研究人员Truong等[15]发现WOAH推荐的荧光PCR探针结合位点的单个错配导致其在ASFV的临床诊断中出现漏检，研究人员将WOAH探针21位的碱基C换成Y，WOAH荧光PCR检测结果为阴性的样品用改进后的方法检出ASFV核酸[16]。

根据WOAH手册，ASFV荧光PCRCt值小于40的样品判为阳性，但在实际临床应用中，Ct值大于35的样品经常会出现扩增曲线不明显，难以判定结果的情况。在应用建立的数字PCR方法进行临床样品检测中发现，阳性样品的C1荧光PCRCt值均低于WOAH荧光PCR检测Ct值；Ct值介于35～40之间且扩增曲线不明显的样品，数字PCR检测拷贝数大于LOD，可判定为阳性。因此本研究建立的ASFV 数字PCR方法在含低拷贝ASFV的样品确认上具有一定优势，对非洲猪瘟的高效防控和口岸动物疫病检测具有十分重要的意义。