鸭甲型肝炎病毒3型对商品肉鸭的致病性研究

张永志，郝东敏，蓝胜芝，嵇康，马海营，邵红霞，秦爱建*

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.法国诗华动物保健公司，浙江 杭州 310020；3.安徽强英鸭业集团，安徽 砀山 200040；4.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的一种对雏鸭呈高度致死性的疾病，临床上以肝脏肿大、出血为主要病变特征，并具有很强的传染性，2周龄以内雏鸭感染时，死亡率可高达90%[1-3]。

鸭肝炎病毒(DHV)分为Ⅰ型(DHV-1)、Ⅱ型(DHV-2)和Ⅲ型(DHV-3)3种血清型，根据国际病毒分类委员会(ICTV)第九次病毒分类报告，DHV-1被划为微RNA病毒科(Picornaviridae)的新属禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)，重新命名为鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)。之后研究人员通过中和试验及衣壳蛋白编码区序列分析，又将DHAV可分为3个血清型或基因型，即DHAV-1型(传统血清Ⅰ型)，DHAV-2型(中国台湾新型)和DHAV-3 (韩国新型)[4-6]。

DHAV是导致我国鸭肝炎发生的主要病原，据报道我国大陆DHAV-1和DHAV-3均有流行，DHAV-2仅在中国台湾地区存在。流行病学调查数据显示DHAV-3型的检出比例正逐年升高，目前已经成为优势流行型，对很多鸭场健康养殖造成严重威胁[7-11]。虽然近年来对DHAV-3的重视程度有了一定的提高，致病机制方面的研究也取得一定的进展，但由于之前DHAV的研究主要集中于DHAV-1，对DHAV-3的研究较少，特别是对血清生化指标变化方面的研究资料更为匮乏。本研究以DHAV-3感染商品代雏鸭，对其引起的主要病理变化和血清生化指标变化进行了观察和测定，以期为DHAV-3致病机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康、体重均匀，无DHAV感染的1日龄商品代强英鸭40只，购自安徽强英鸭业集团有限公司。

1.2 攻毒毒株

攻毒用DHAV-3强毒SD20株由浙江诗华诺倍威生物技术有限公司实验室分离制备保存，毒种效价为107.5DELD50/0.2 mL。

1.3 试剂与设备

血清生化指标检测相关试剂盒为上海复星长征医学科学有限公司产品；伊红、苏木素为上海蓝季公司产品；全自动生化分析仪BS2000M由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产。

1.4 试验设计

将40只健康的强英鸭商品代雏鸭，在隔离器中饲养至10日龄，随机平均分为2组，每组20只。第1组为攻毒组，每只雏鸭采用滴口方式接种DHAV-3型强毒SD20株1 mL(含106.5DELD50)；第2组为对照组，每只雏鸭分别接种等量生理盐水。攻毒后24和48 h，试验组和对照组各随机选取5只雏鸭采集血液样品(攻毒后攻毒组存活数不足5只时全部采血)，分离血清后置-80 ℃超低温冰箱保存备用。对攻毒后死亡的雏鸭分别采集肝、脾、肾、脑、胰腺和法氏囊组织，并置于10%福尔马林溶液固定，进行病理组织学观察。

1.5 血清生化指标

将分离的血清用全自动生化分析仪分别进行肝功能、肾功能、血糖水平等相关的15项生化指标测定。具体测定分析项目包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白蛋白/球蛋白(A/G)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、ALT/AST、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、葡萄糖(GLU)。

1.6 组织病理学观察

将固定好的组织样品按常规方法包埋切片，HE染色后，通过光学显微镜进行组织学病变观察。

1.7 统计与分析

对血清生化指标采用 SPSS 26软件中独立样本t检验方法进行显著性分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 DHAV-3强毒感染商品肉鸭的发病情况

攻毒后第 2 天，攻毒组内部分雏鸭开始出现缩脖、精神沉郁、拉稀等临床症状，攻毒后36 h开始出现死亡，7 d内累计死亡17只，死亡率为85%。感染后发病雏鸭死前伴有典型的角弓反张姿势，剖检病变主要为肝脏出现大小和数量不等的出血点和出血斑，并且部分病死鸭还出现肾脏和脾脏肿胀，如图1所示；对照组雏鸭在整个试验期间均全部健康，采食、饮水、精神状态等均正常，说明攻毒模型成立。

A1.攻毒死亡雏鸭肝脏严重出血，存在大小和数量不等的出血点和出血斑；B1.部分攻毒死亡雏鸭肾脏肿胀，出现尿酸盐沉积；C1.部分攻毒死亡雏鸭脾脏肿胀，呈斑驳状；D.攻毒组雏鸭死亡前出现神经症状，呈角弓反张姿势；A2、B2、C2.分别为对照组雏鸭剖检的肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。图1 DHAV-3型强毒攻毒死亡雏鸭的病理变化和临床症状

2.2 DHAV-3强毒感染鸭组织病理观察

组织学检查结果显示，攻毒后死亡雏鸭的肝细胞变性肿胀、坏死，呈灶状或弥漫性分布，部分病变肝组织中有大量红细胞；脾脏红髓充血、出血，白髓结构模糊，组织细胞变性坏死，淋巴细胞减少；肾小管上皮细胞肿胀，呈颗粒变性，间质充血，炎性细胞浸润；脑组织胶质细胞增生，神经元变性坏死；胰腺上皮细胞灶状变性坏死，并见淋巴细胞浸润；法氏囊滤泡皮、髓质区淋巴细胞坏死、数量减少，具体病理变化见图2。

A1.攻毒死亡雏鸭肝脏充血、出血，肝细胞变性坏死，坏死呈灶状或弥漫性分布；B1.攻毒死亡雏鸭脾脏红髓充血、出血，白髓结构模糊，组织细胞变性坏死，淋巴细胞减少；C1.攻毒死亡雏鸭肾小管上皮细胞变性肿胀、肾间质充血、炎性细胞浸润；D1.攻毒死亡雏鸭脑组织胶质细胞增生、神经元变性坏死；E1.攻毒死亡雏鸭胰腺上皮细胞灶状变性坏死，并见淋巴细胞浸润；F1.攻毒死亡雏鸭法氏囊滤泡皮、髓质淋巴细胞坏死，减少。A2、B2、C2、D2、E2、F2分别为对照组肝脏、脾脏、肾脏、脑、胰腺和法氏囊组织切片，均组织结构正常，细胞轮廓清晰，形态完好。图2 DHAV-3型强毒攻毒死亡雏鸭的病理组织学变化(HE，200×)

2.3 DHAV-3强毒感染鸭血清生化指标变化

对DHAV-3强毒SD20攻毒雏鸭后不同时段的血清生化指标采用常规方法测定，结果显示，滴口攻毒后24 h，攻毒组与对照组相比，DBIL显著下降(P<0.05)，GGT显著升高(P<0.05)，CR显著升高(P<0.05)，其他所检测的血清生化指标均未发现明显变化。然而，攻毒后48 h结果显示，攻毒组ALB、DBIL 2项指标显著升高，与对照组差异显著(P<0.05)；与对照组相比，A/G、ALT、AST、GGT、BUN、CR 6项指标均极显著升高(P<0.01)；ALT/AST、GLU 2项指标均极显著下降(P<0.01)；其他所检测的血清生化指标TP、GLO、TBIL、IBIL和ALP与对照组相比，均无显著性变化(P>0.05)。具体检测结果见表1。

表1 DHAV-3型强毒攻毒后雏鸭血清生化指标比较

3 讨论

DHAV-3对雏鸭具有很强的致病性，其感染后的发病进程与组织病理损伤程度和血液生化指标变化密切相关。本研究发现，DHAV-3感染除对雏鸭肝脏造成严重病变外，对肾脏、脾脏、脑、胰腺、法氏囊也会造成广泛的组织病变和损伤，从而从整体上影响机体各组织器官的功能。DHAV-3感染鸭的血清生化指标中与肝炎相关的指标会发生显著变化。DBIL、GGT、CR是DHAV-3感染的早期敏感性指标；ALB、DBIL、A/G、ALT、AST、GGT、BUN、CR、ALT/AST、GLU也会随着肝炎的发展和病理进程发生明显改变。这些血清生化指标的变化与人的肝炎相类似，提示雏鸭甲型肝炎有作为人肝炎疾病研究模型的潜力。

肝脏是机体含酶最丰富的器官，这些酶在全身物质代谢及生物转化中发挥着重要的作用，并且一些酶具有一定的组织特异性，是肝胆疾病诊断的重要指标和依据[12-13]。攻毒后48 h，ALT升高了约9倍，AST升高了约138倍，说明DHAV-3感染导致雏鸭出现了急性重症肝炎，肝细胞损伤严重，从而使这些酶类释放进入血液，血清中的酶活性出现了升高。DHAV-3感染后ALT、AST的变化趋势，与多数学者关于鸭病毒性肝炎的研究结果一致[14-16]，也与本研究中肝脏组织切片显示的肝细胞损伤情况相符，但与陈阳等[17]对金定鸭感染研究中AST的变化规律存在差异，推测可能与不同攻毒毒株致病特性或鸭的品种等因素有关。同时，也有一些研究也表明，采用注射途径攻毒时，雏鸭血清生化指标的变化要早于滴口感染途径[18]。

血清中的肌酐和尿素氮是判断肾小球损害的重要指标。当肾实质受到损害，肾小球滤过率下降时，肌酐和尿素氮浓度就会急剧上升。DHAV-3攻毒后，雏鸭血清中肌酐和尿素氮短期内的急剧上升，表明肾脏出现严重损伤，这与剖检和组织病变镜检结果相一致。

DHAV-3滴口接种后48 h，雏鸭血清TP有所上升，GLO略有下降；但ALB检测显示在接种后48 h时上升明显，与对照组差异极显著，推测TP和ALB的上升与病毒感染后急性失水或肾上腺皮质功能减退，导致失水后血清单位容积蛋白浓度增高，血液出现浓缩有关。另外，感染后48 h时，攻毒组GLO含量降低，说明肝脏功能下降。

血糖浓度测定结果显示，攻毒后24 h血液中GLU浓度略有下降，攻毒后48 h时下降更为明显，并与同期对照组相比差异极显著，表明随着病程的不断发展，肝脏调节糖代谢的机能出现紊乱，这一结果与其他研究人员有关DHAV-1型毒株感染后的血糖检测结果相一致[19]。

4 结论

DHAV-3对雏鸭致病性较强，感染可引起多种组织病变，并导致多项血清生化指标发生显著改变，这些变化与鸭病毒性肝炎的发病进程密切相关。