氨苯砜胶体金免疫层析试纸条研制及其在牛尿液样本检测中的应用

谭磊，智军海，过大江，陈彤，何玉榆，全志学

(1. 深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518000；2. 广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518000；3. 天津华测检测认证有限公司，天津 300000；4. 华测检测认证集团股份有限公司，广东 深圳 518100；5. 深圳市市场监督管理局龙岗监管局，广东 深圳 518114)

氨苯砜(dapsone，DDS)化学名为4，4′-磺酰基二苯胺，或者4，4′-二氨基苯砜，分子式为C12H12N2O2S，是一种白色结晶粉末[1]。由于其可以对麻风杆菌有较强的抑制作用，临床上主要用于麻风病和某些皮肤类疾病的治疗[2]。据报道较大剂量使用氨苯砜时会有明显的杀菌作用，与磺胺类增效剂有相似的作用机制，因此也可以作为磺胺增效剂用于水产品养殖过程，主要用于防治鱼类细菌性疾病[3]。氨苯砜会引起一些血液性疾病，是因为氨苯砜的氧化能力相对较强，在血液中可以把血红蛋白氧化成血铁蛋白，使血红蛋白无法携带氧气，而且严重的还可能会造成死亡[4]。为此我国农业农村部193号、235号公告做了明确规定，禁止在所有食品性动物中使用氨苯砜，且不得在动物食品中检出；欧盟也在《欧盟动物源性食品兽药最高残留限量规定》中将其列为禁用药物[5]。

目前国内外关于食品中氨苯砜的报道主要在蜂蜜、牛奶、鸡肉、猪肉、鱼肉等样品的检测，常用的仪器方法有高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)。仪器方法可以实现精确的定量分析检测[6-8]，但是也有其本身的不足，其设备昂贵，对人员的操作相对要求较高，样品的前处理比较复杂，检测成本较高，检测周期长，在实际检测过程中无法对大量样本进行快速筛查，也无法满足养殖过程中实时监测需求。

此外，已经报道的快速检测方法有酶联免疫吸附测定法 (ELISA)[5]和胶体金免疫层析法[3]等方法。虽然这些方法可以实现对组织类样本的快速检测和大量筛查，但是也存在着滞后性，无法实现在养殖环节的实时监测。因此，亟需要开发一种既不对动物造成伤害，同时又可以实现在动物养殖过程中实时监测的快速检测方法。

本试验建立了牛尿液中氨苯砜残留量胶体金免疫层析快速检测方法，检测样本由传统的牛肌肉组织变成尿液，尽管检测样本发生了变化，但样本不需要复杂的前处理，也缩短了前处理的时间，实现了养殖现场实时检测，同时不会对动物造成伤害。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

新西兰大白兔(6月龄，体重5 kg)由青龙山动物饲养中心(南京)提供，所有动物饲养和免疫程序按照华测检测认证集团北京实验室提供的方案进行。

氨苯砜、葡胺苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)(纯度≥99%，美国Sigma公司)；羊抗兔IgG(无锡杰圣杰康生物科技有限公司)；碳酸钾、氢氧化钠、异丙醇、戊二醛(GA)、蔗糖、二甲基甲酰胺(DMF)、吐温-20(分析纯，国药集团)；硝酸纤维素(NC)膜(CN140，德国Sartorius公司)；样品垫、吸水垫、PVC底板 (上海捷一生物科技有限公司)；胶体金专用重悬液、样本专用复溶液由天津华测检测认证有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 氨苯砜抗原的合成

以DDS-OVA偶联物作为免疫原，免疫抗原的合成参考戊二醛法[9]，具体步骤：称取DDS 5 mg溶解于500 μL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入20 μL 25% GA，4 ℃保持10 min，然后用超纯水稀释5倍，再4 ℃避光，放置15～30 min，制备成A液。称取OVA蛋白20 mg置于棕色的小玻璃瓶内，溶解于4 mL的碳酸钠缓冲液(0.05 mol/L，pH=9.6)中，制备成B液。然后在避光条件下将A液加入B液中，同时不断搅拌，制备合成DDS-OVA免疫原。装入透析袋中，然后再用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L pH=7.4)进行透析。

包被抗原DDS-BSA，参考DDS-OVA的合成方式进行合成，之后进行透析去除未与蛋白结合的小分子。

1.2.2 氨苯砜多克隆抗体的制备

取6月龄新西兰大白兔，以DDS-OVA作为免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，选择背部皮下多点注射方式，首次免疫时每只兔注射0.5 mL混合液，之后第3天进行第2次免疫注射，按照DDS-OVA与弗氏不完全佐剂1∶1的比例混合，注射剂量为400 μL/只[10]。分别在第30天进行第3次免疫，第45天进行第4次免疫，免疫剂量参考第2次，共免疫4次。用乳化的弗氏不完全佐剂进行后2次免疫[11]。间隔3周后，将0.3 mL不添加佐剂的免疫原通过腹腔注射免疫大白兔，3天后刺穿心脏采集兔全血，4 000 r/min 离心5 min，收集血清即为抗氨苯砜血清。通过Protein A柱子纯化获得氨苯砜多克隆抗体[12]。

1.2.3 氨苯砜多克隆抗体-胶体金标记物微孔试剂的制备

取0.01%的胶体金溶液100 mL[13]，用0.1 mol/L K2CO3调节pH值至8.5左右，再加入3 500 μg氨苯砜多克隆抗体，在室温下搅拌均匀后，静置30 min。加入1 mL 10% BSA，再搅拌30 min，然后静置20 min，在4 ℃条件下12 000 r/min离心20 min，弃上清液[14]，沉淀使用20 mL胶体金重悬液(2%蔗糖，3% BSA，0.3% Tween-20，由0.04 moL/L pH值为8.0的Tris-HCl配制)重悬后放于4 ℃冰箱中备用[15]。

将氨苯砜多克隆抗体标记胶体金后加入微孔中，100 μL/孔，待冷冻干燥机冷阱温度降到-70 ℃后，微孔先预冻3 h，再转移到冷阱中真空干燥24 h，将冻干的混合试剂保存到干燥密封的环境中[14]。

1.2.4 试纸条制备与组装

在NC膜的检测线(T)和质控线(C)处，分别包被适当浓度的氨苯砜-BSA偶联物和羊抗兔IgG抗体，在PVC底板上依次粘贴NC膜、样品垫、吸水纸，其中样品垫、吸水纸与硝酸纤维素膜搭接约2 mm[16]。将组装好的试纸条大板斩切成4 mm宽的试纸条，干燥条件下，室温下密封于铝箔袋内保存备用[17-18]。

1.2.5 牛尿液样品的处理

从待测样品管中取2 mL牛尿液加入离心管中，室温下4 000 r/min离心5 min。将离心后的上清液转移到2 mL离心管中，即得到待检液[14]。

1.2.6 样品的检测及结果判定

取待检液200 μL加入到氨苯砜抗体金标微孔中，反复吹吸几次使微孔内部的红色物质完全溶解，待完全溶解后，在微孔内反应3 min，再从微孔内移取100 μL加到试纸条的加样孔内，层析5 min后读取结果，其余时间判读无效，根据示意图(图1)判定结果。阴性(-)：C线比T线显色浅或两者颜色相同，则样本中氨苯砜的含量低于检出限或不含氨苯砜；阳性(+)：T线显色比C线浅或T线不显色，表示样本中氨苯砜含量大于检出限；无效：C线不显色，表明本次检测结果失效。

图1 结果判定示意图

1.2.7 试纸条质量评估

检出限的确定：在空白牛尿液样品中分别添加质量浓度为0、1.25、2.5、5、10 μg/L的氨苯砜标准品，使用3个不同批次的试纸条进行检测，根据试验结果确定氨苯砜快速检测试纸条的检出限。

特异性试验：选择与氨苯砜化学结构、功能相似的药物进行检测。分别配制0、5、50 μg/L的氨苯砜、葡胺苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜，使用试纸条进行检测，根据结果判断氨苯砜快速检测试纸条的特异性。

准确性试验：取实验室保存的空白牛尿液样品和添加氨苯砜2.5、5、10 μg/L的牛尿液样品各50份，使用3个不同批次的试纸条进行检测，分别计算假阳性率和假阴性率。此外，取20份盲样样本，根据SN/T 2219—2008《进出口动物源性食品中氨苯砜及其代谢产物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[8]对样品进行检测，同时用氨苯砜试纸条进行检测。比较2种方法的一致性。

稳定性试验：将试纸条密封于铝箔袋中，于室温环境下保存，每个月随机选取一定数量的试纸条对添加氨苯砜5 μg/L的牛尿液样品进行检测并重复检测3次，连续测定18个月。

2 结果与分析

2.1 抗原鉴定

由于氨苯砜分子量较小，为了获得抗氨苯砜的多克隆抗体，需要将DDS-OVA偶联物作为免疫原。然后用DDS-BSA偶联物作为包被原，包被到NC膜上进行检测。通过紫外扫描进行初步鉴定可以看出，氨苯砜的特征吸收峰位于260 nm处，而OVA和BSA蛋白的特征吸收峰位于280 nm处，而DDS-OVA和DDS-BSA偶联物的特征峰在270和315 nm有2处特征吸收峰(图2)，说明DDS-OVA和DDS-BSA偶联成功，获得了用于免疫的氨苯砜的免疫抗原和制备试纸条的包被抗原。

图2 不同偶联物紫外扫描图谱

2.2 检出限

在牛尿液中添加不同浓度的氨苯砜标准品使其浓度分别为0、1.25、2.5、5、10 μg/L，然后用氨苯砜快速检测试纸条进行检测。当牛尿液中氨苯砜含量为0、1.25、2.5 μg/L时，C线比T线显色浅，表明检测结果为阴性；当氨苯砜含量为5、10 μg/L时，T线显色比C线浅(见图3)，平行试验间检测结果均为阳性。由此可以确定本试纸条检测限为5 μg/L。

Ⅰ～Ⅴ.氨苯砜浓度分别为0、1.25、2.5、5和10 μg/L。图3 氨苯砜快速检测试纸条检测限比较

2.3 特异性

使用氨苯砜快速检测试纸条检测与氨苯砜化学结构、功能相似的不同浓度药物时，结果均为阴性，而对超出检测限的氨苯砜进行检测时，结果呈阳性，具体结果见表1，表明本试纸条可以特异性检测氨苯砜的残留而与其他药物无交叉反应。

表1 氨苯砜快速检测试纸条特异性比较

2.4 准确性

取实验室保存的空白牛尿液样品和添加氨苯砜2.5、5、10 μg/L的牛尿液样品各50份，使用3个不同批次的试纸条进行检测，根据检测结果可以看出，空白牛尿液样品中未检测出阳性结果，氨苯砜添加量为2.5 μg/L的牛尿液样品检测结果中，出现4例阳性结果；当氨苯砜添加量为5和10 μg/L时，其检测结果全部为阳性，未出现阴性结果。该方法的假阳性率为1.33%(4/300)，假阴性率为0。

取浓度含量不同的实际样品，分别用氨苯砜胶体金卡快速检测试纸条和液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MS)进行检测，检测结果见表2，从中可以看出，2种方法的检测结果相符，说明了2种方法之间具有较好的一致性。

表2 氨苯砜快速检测试纸条与HPLC-MS/MS检测结果比较

2.5 稳定性

将试纸条常温密封保存，其间用氨苯砜5 μg/L的牛尿液每月进行1次检测，连续检测18个月。前13个月内试纸条检测结果无异常，均为阳性；在第14个月至第18个月的检测中发现，试纸条偶有出现假阴性(见图4)，结果不稳定。从整体上看试纸条的稳定性可以满足现场使用的要求。

1～18.分别代表1～18个月。图4 氨苯砜快速检测试纸条连续放置18个月稳定性检测

3 讨论

氨苯砜对治疗角质层下脓疱性皮炎、血管炎和天胞疮有较明显的作用，但是存在着严重的副作用，如贫血、中性粒细胞减少症、血小板减少症和肝毒性[2]。由于其残留会对人有较严重的危害，因此国家规定在动物源性食品中禁止检出氨苯砜[19]。但由于其价格便宜同时防治效果好，国内一些养殖户仍未停止使用氨苯砜，这对我国的动物源性食品安全存在着较大的隐患[8]。目前，传统的仪器检测法仪器设备价格高昂，检测时间长，且无法实现现场检测。本文使用氨苯砜-OVA 偶联物作为免疫原制备出氨苯砜多克隆抗体，再结合免疫层析原理成功研制出快速检测牛尿液样品中氨苯砜残留量的胶体金试纸，可应用于基层现场检测，同时还可以实现在养殖过程中对氨苯砜的实时监测。

根据特异性试验结果可以看出，本试验研制的氨苯砜试纸条与葡胺苯砜、苯丙砜及醋氨苯砜之间无交叉反应，具有良好的特异性。在检测样品时，出现个别的假阳性结果。一部分原因是牛尿液存在成分复杂、离子浓度高和pH值差异较大的特点，而前处理只做了离心[16]，相对比较简单；另一部分原因可能是胶体金标记的氨苯砜多克隆抗体由于氨苯砜随着时间的推移，环境温度和pH值的变化会发生一定的降解[13，15]，又有可能是不同快速检测试纸条之间存在个体差异[14]。但假阳性率很低，结合液相色谱的检测结果，两者一致性较好，说明试纸条检测结果准确可信。常温下，试纸条的保质期在1年以上，在此期间检测结果准确、稳定，可满足现场快速检测的要求。

4 结论

氨苯砜胶体金快速检测试纸条的检测限为5 μg/L。本试纸条由于其携带方便、前处理过程简单、准确度高等优点，可以广泛应用于牛尿液样品现场快速检测，能够做到在牛生产养殖过程中的实时监测，进一步保障了牛肉产品的安全，具有较强的基层使用价值。