兰州市宠物猫隐孢子虫流行情况调查及分子生物学鉴定

2023-10-19李雅琪王玉桂邹扬张月玥马平平叶得河王帅马永华

畜牧与兽医 2023年10期

李雅琪，王玉桂，邹扬，张月玥，马平平，叶得河，王帅，马永华*

(1. 甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2. 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室/农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃兰州 730046)

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要专性胞内寄生且具有人畜共患性的机会性致病原虫，可感染多种脊椎动物[1-3]。由隐孢子虫感染导致的隐孢子虫病是人类最常见的6种腹泻病之一[4]。隐孢子虫主要通过粪-口途径和水源传播[5-6]，其卵囊进入宿主体内后，定殖在消化道上皮细胞内进行发育[7-8]。据现有报道，隐孢子虫可感染所有脊椎动物，且通常患病动物会通过粪-口途径和水源途径感染人类，严重威胁人类健康[9]。免疫力正常人群感染会出现急性自限性腹泻，免疫力低下和免疫缺陷人群感染可引起水样腹泻，严重时会危及患者生命。

研究表明，伴侣动物，特别是宠物犬猫，不仅对宠物主人的心理健康有着正向的影响，同时对于部分疾病也有着辅助治疗的作用[10]。宠物猫作为常见的隐孢子虫宿主，长期与宠主接触增加了人兽共患传染病的传播风险。1979年研究者首次在宠物猫身上发现了隐孢子虫[11]。对宠物猫粪便中隐孢子虫的基因研究表明，其感染虫种主要为猫隐孢子虫(Cryptosporidiumfelis)[12-16]。猫隐孢子虫极易传染给人类，已有部分亚型在儿童、免疫正常病人、免疫缺陷病人及其他多种动物的粪便样品中发现，猫隐孢子虫已被列为感染人类的5个重要虫种之一[3]，并在大量人隐孢子虫病例中报道。Meng等[11]将1988—2021年猫隐孢子虫感染全球流行状况进行了系统性回顾分析，整理绘制出全球猫隐孢子虫的流行地图，发现全球猫隐孢子虫的感染率在0.6%～40.8%，其中肯尼亚的猫隐孢子虫感染率为40.8%(95%置信区间：31.4～50.5)，显著高于其他国家和地区，中国地区的猫隐孢子虫感染率为3.4%(95%置信区间：1.8～5.2)。

隐孢子虫基因组已有几个遗传位点被开发并作为分子诊断工具供临床使用来鉴定虫种亚型。其中扩增小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因位点的方法使用较广泛[17-18]。本试验基于SSU rRNA序列采用套式PCR扩增调查兰州市宠物猫隐孢子虫的感染情况，经过测序鉴定感染虫种亚型，分析易感因素，为预防控制隐孢子虫感染提供理论依据[19-23]。

1 材料与方法

1.1 样品来源与保存

2020年1月至2022年6月从兰州市五大主城区的宠物医院、繁育猫舍及宠物市场获取宠物猫粪便，保存于一次性无菌离心管中，记录宠物猫品种、年龄、性别、来源等信息。将样品及时送回实验室，保存在-80 ℃冰箱中。各城区样品分布情况如图1所示。

1.2 主要试剂

E.Z.N.A.®Stool DNA Kit 粪便DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司；r-TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、6×Loading Buffer、25 mmol MgCl2、DL1000 DNA Marker均购自TaKaRa公司；50× TAE购自生工生物工程(上海)股份有限公司；溴化乙锭(EB)购自美国Sigma公司。

M.相对分子质量标准；+.阳性对照；-.阴性对照；1～10. 粪便样品。图2 隐孢子虫SSU rRNA套式PCR扩增结果

1.3 粪便DNA提取

为提高粪便纯度，先进行预处理。将粪便置于50 mL烧杯中，加入40 mL ddH2O混匀后，用60目的金属过滤筛过滤，滤液收集在50 mL离心管内，8 000 r/min，离心10 min，弃去上清液，沉淀用于后续试验。取200 mg沉淀于2 mL无菌离心管中，参照OMRGA E.Z.NVA.®Stool DNA Kit试剂盒说明书提取粪便中的DNA，并于-20 ℃保存。

1.4 套式PCR扩增

基于SSU rRNA序列，引用参考文献[19]中扩增引物。扩增第1轮上游引物为：5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′，下游引物为：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′；第2轮扩增上游引物为：5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，下游引物为：5′-GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG-3′。引物由西安擎科泽西生物有限公司负责合成。对所提取的DNA样品进行套式PCR扩增，套式PCR反应体系为25 μL，反应共进行2轮，第1轮扩增产物作为第2轮的模板。

1.5 核酸电泳及测序分析

取终轮PCR产物5 μL与1 μL DNA Loading Buffer混匀后加入含有溴化乙锭(EB)的1.2%琼脂糖凝胶中，160 V电泳15 min，置于成像系统中拍照检测，将有目的条带的PCR样品原液送至西安擎科泽西生物有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件编辑和校准序列，在NCBI网站进行序列比对来确定虫种亚型。

1.6 统计学分析

以兰州市宠物猫的年龄、品种、性别、季节、采样地区及样品来源作为试验相关因素，利用SPSS 25.0分析软件中的风险因素和χ2检验，分析宠物猫隐孢子虫的感染率和相关风险因素，通过计算其感染率的优势比(odds ratio，OR)和95%置信区间，分析猫隐孢子虫在不同来源、地区、季节、年龄、品种及性别之间是否存在显著差异，当P<0.05或P<0.01时，表示差异具有统计学意义。

1.7 遗传进化及发育分析

从NCBI网站的GenBank 数据库中下载部分猫隐孢子虫的序列作为参考序列，并将本试验中的基因序列上传至GenBank数据库获取基因号，运用MRGA 11软件中的最大似然(Maximum Likelihood)法构建进化树。

2 结果与分析

2.1 兰州市宠物猫隐孢子虫感染情况

运用套式PCR扩增法，对隐孢子虫的SSU rRNA基因位点进行扩增，在655份样品中，成功扩增出了26份阳性样品，总感染率为3.97%(26/655)。部分样品的凝胶电泳图如图1所示，扩增出的目的片段大小约为380 bp。

2.2 不同年龄组宠物猫感染情况

对宠物猫年龄进行分组，分别计算隐孢子虫感染率，结果显示，3～10月龄的宠物猫感染率最高为6.16%，1～3月龄宠物猫感染率次之为3.85%，不同年龄段的感染情况详见表1。感染组中年龄最小为2月龄，最大为4岁3月龄，由此可见，隐孢子虫可以感染各个年龄段的宠物猫，且各年龄段之间感染情况并无统计学差异。

表1 不同年龄、性别、品种宠物猫隐孢子虫感染情况

2.3 不同性别宠物猫感染情况

在收集的655份样品中，雄性样品占47%，雌性样品占53%，不同性别的宠物猫感染情况详见表1。通过计算可知，不同性别之间的感染率无显著差异。

2.4 不同品种宠物猫感染情况

本试验共涉及21个常见宠物猫品种，包括中华田园猫、美国短毛猫、英国短毛猫、加菲猫、布偶猫、蓝猫、银点猫、银渐层猫、金渐层猫、斯芬克斯无毛猫、阿比西尼亚猫等，其中有6个品种检出隐孢子虫，各品种感染情况详见表1，在本次试验中，金渐层猫的感染率最高为18.18%，且不同品种之间的感染率存在显著的差异(P<0.05)。由此推断，宠物猫的品种是影响隐孢子虫感染的主要因素之一。

2.5 不同地区宠物猫感染情况

本试验采样区域为兰州市五大主城区(城关区、七里河区、安宁区、西固区、红谷区)，主城区中，仅有城关区与七里河区检出阳性样品，各地区的感染情况如表2所示，城关区与区七里河区的感染率分别为7.52%和3.35%，经统计可知，不同地区之间感染率并无显著差异。

表2 不同地区、季节、来源宠物猫隐孢子虫感染情况

2.6 不同季节宠物猫感染情况

试验样品采集耗时1.5年，根据采样季节对样品进行划分，各季节宠物猫隐孢子虫感染情况如表2所示，各季节采集的样品均有检出隐孢子虫，夏季共采集样品235个，占样本总数的36%，感染率为7.66%，感染率显著高于其他3个季节，不同季节感染率之间也存在显著的差异(P<0.05)。因此季节因素也是影响宠物猫感染隐孢子虫的主要因素之一。

2.7 不同来源宠物猫感染情况

样品分别来自宠物市场、繁育猫舍及宠物医院，不同来源地的感染情况详见表2。宠物市场的感染率(7.96%)远高于繁育猫舍(4.56%)及宠物医院(1.93%)。经检验发现，采样场所之间感染率的差异也较为显著(P<0.05)。样品来源地也是影响隐孢子虫感染的因素之一。

2.8 隐孢子虫虫种鉴定及遗传进化发育分析

对26份PCR阳性样品测序鉴定，结果均为猫隐孢子虫。使用MEGA 11软件采用最大似然(Maximum Likelihood)法构建遗传进化树，结果如图3所示。测序样品与已鉴定出的猫隐孢子虫(基因登记号为KY882321.1)的相似性为99%以上。通过构建进化树发现，所有阳性样品均与中国上海地区鉴定出的猫隐孢子虫(基因登记号为MT458670)位于同一分支上，且发育树中的Bootstrap值较高，提示两种分离珠遗传进化关系较近。本研究中鉴定的猫隐孢子虫阳性序列已上传至GenBank数据库，获得了基因登记号为OP345050～OP345056。

▲为本试验阳性样品。图3 基于SSU rRNA基因位点得到的猫隐孢子虫进化关系树

3 讨论

3.1 不同来源地感染率差异分析

根据试验结果可知，不同来源地的宠物猫感染隐孢子虫的情况有所不同，这可能与饲养方式和生活环境有关。分析采样信息可知，46.9%的样品来自于繁育猫舍，这些猫舍大多存在于居民住宅区中，饲养密度大，空间相对局限，且存在共用猫砂盆、食碗、水碗等现象。一旦出现个体感染，极易引起群体暴发感染。繁育猫舍宠物猫数量过多，宠主难免会照顾不周，忽视其健康问题。建议繁育猫舍控制饲养密度，加强环境的清洁，定期对猫砂盆进行消毒清洁，更换猫砂，及时对食碗、水碗进行清洗消毒。

在本试验中，来自宠物市场的宠物猫隐孢子虫的感染率也较高，这些宠物猫与外界环境接触较为频繁，部分宠物猫是从外地引进，对之前的生活饲养史了解甚少，有可能之前已经感染了隐孢子虫，但由于没有明显症状出现，无法进行判断。对于宠物医院样本，调查宠物猫病史可知，有超过30%的宠物猫就诊前出现过不同程度的腹泻，平时散养在家，偶有误饮生活用水和啃食盆栽的习惯，这也有可能造成隐孢子虫感染。

3.2 不同季节感染差异分析

据统计，夏季隐孢子虫的感染率偏高，这可能与当地气候环境因素有关。兰州市位于我国西北部，甘肃省的中部，属于温带大陆性气候，年平均气温10.3 ℃，降水主要集中在6至9月，温暖潮湿的环境十分适合寄生虫病的发生与传播。很多宠主认为宠物猫平常不出门，没有必要进行体内外驱虫，但从本试验结果可知，宠物猫感染体内寄生虫的现象还是普遍存在的，尤其在夏季多发，因此做好体内外驱虫是十分重要的。

3.3 不同年龄段感染差异分析

分析发现，3～10月龄的宠物猫隐孢子虫感染率为6.16%(9/146)，显著高于其他年龄组。此结论与委磊等[20]在兰州市流浪犬蠕虫感染情况调查中的结论一致。对于3月龄的幼猫幼犬，可以进行初次免疫，整个免疫过程长达42～56 d。免疫疫苗属于弱毒疫苗，注射后，会造成机体抵抗力下降，在此期间极易感染其他疾病。本试验中感染隐孢子虫的宠物猫在2月龄至4岁不等，可见隐孢子虫可以感染不同年龄段的宠物猫，且成猫感染后症状不明显，往往不能及时发现，故更要引起重视。

3.4 不同动物隐孢子虫的感染情况

在我国，隐孢子虫已在多种动物及人类身上检出，但感染率之间差距较大。国内对于饲养经济动物及宠物的隐孢子虫感染报道较为多见，详见表3。饲养经济类动物如马、山羊、猪等可感染不同种类的隐孢子虫。国内现有报道均表明宠物猫仅感染猫隐孢子虫，且暂未发现其他种类。值得注意的是，犬猫隐孢子虫亚型均为人兽共患，需引起高度重视。

表3 中国不同地区不同动物隐孢子虫感染情况

3.5 宠物猫隐孢子虫防治建议

隐孢子虫作为重要的介水传播病原微生物，其卵囊在水中可存活数月，故被美国环境保护署(EPA)和世界卫生组织(WHO)列为规定的饮用水必检病原微生物。宠物猫饮用自来水或误饮生活废水也会增加感染隐孢子虫的风险[9]。张晓等[6]在2014年检测了我国部分地区的水源水和末梢水中隐孢子虫，结果显示，水源水及末梢水中均有隐孢子虫的虫卵存在，因此本试验中的宠物猫隐孢子虫极有可能是介水传播感染。建议条件允许的情况下，勿用未加热的自来水喂养宠物猫，可以选用凉开水或者纯净水喂养[6]。同时尽量避免喂食生肉，可加工煮熟后饲喂。在家中无人时圈养宠物猫，避免误食和误饮。

据统计，发展中国家人的隐孢子虫感染率在4%～20%，鉴于本试验宠物猫感染率较高，且猫隐孢子虫属于可感染人类的5种隐孢子虫种之一[3]，人猫接触频繁，关系密切，人畜共患的风险也随之升高。目前为止还没有针对隐孢子虫的疫苗或者预防性药物，因此需要引起重视。在实际临床病例中，医生有责任和义务对宠主进行知识普及，通过粪便检查对隐孢子虫进行筛查，及时发现并治疗，从而避免人畜共患病的发生。