云南部分地区牛羊体表寄生蜱的形态及分子鉴定

陈俊蓉，徐翠蓉，谢昕言，邹丰才，贺君君，杨建发

(云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

作为仅次于蚊的第二大传染病媒介生物，蜱隶属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，寄螨目(Parasitiformes)，蜱亚目(Ixodida)，是一类寄生在陆栖脊椎动物上专性吸血的寄生虫[1]。1983年两位美国学者在德克萨斯州证实，蜱是多种病毒、原虫、细菌等的传播媒介或储存宿主，目前全世界已发现800多种，已确定至少能传播217种病原[2-3]。蜱在世界范围内广泛分布，每年造成巨大的经济损失，Bainard等[4]利用计算机模拟得出，因为牛体表寄生蜱而导致美国养牛业每年生产损失超过7 000万美元。我国四川苍溪县曾遭受嗜群血蜱(Haemaphysalisphiloxeroides)危害，受害面积占97.4%，感染人及家畜共计50多万，严重威胁人体健康，阻碍畜牧业的发展[5]。在蜱的诸多种类中，微小扇头蜱(Rhipicephalusmicroplus)可携带160种病毒，其中25%左右为人兽共患病原，如立克次体、埃立克体等[6-7]。研究发现云南省西北地区的优势蜱种为微小扇头蜱，此外，昆明地区也有微小扇头蜱分布的报道[8-9]。

Anderson等[10]研究表明，线粒体作为一个重要的细胞器，具有自身独立的tRNA、rRNA基因，细胞色素基因作为稳定遗传物质而存在，常被称为核外独立因子。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome coxidase subunitⅠ，coxⅠ)基因在遗传进化中比较保守，适用于蜱的分类鉴定及系统发育分析[11-12]。

云南省作为我国蜱类分布最多的地区之一，针对蜱的种类开展研究有助于科学防控蜱媒疾病[13]。本研究对云南地区采集的牛羊体表寄生蜱进行形态学观察及coxⅠ基因的PCR扩增，分析比对扩增序列，研究其与其他种属蜱间的系统进化关系，以期为家畜体表寄生蜱种类的研究提供数据支撑，同时为后期家畜养殖体表寄生蜱的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 蜱虫样品的采集与保存

本试验于2021年8月份至9月份期间采集云南6个地区的牛羊体表蜱共计455只，置于75%酒精，于-80 ℃条件下保存。样品来源及数量如表1所示。

表1 样品来源及组成

1.2 主要试剂

血液/组织/细胞基因组提取试剂盒、无水乙醇、50×TAE缓冲液及ddH2O，均购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖粉，购自昆明诺华生物科技公司；2×AccurateTaq预混液(含染料)，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；GelStain核酸染料 (全式金)购自丰科生物科技有限公司；DNA Marker DL2000为TaKaRa试剂公司产品。

1.3 主要仪器设备

体视光学显微镜(ST6024-B1)，南京新睿之鸿光学仪器有限公司产品；高速台式离心机(Model CF-10)，Wise Spin公司产品；PCR仪(PTC-1148)，Bibby Scientific公司产品；凝胶成像系统(WGD-30)，大韩科学仪器有限公司产品。

1.4 形态学鉴定

将蜱放入ddH2O，放置于4 ℃冰箱，浸泡30 min后更换1次，重复3次，以充分去除酒精浸泡液。置于滤纸上吸干水分，使用体视光学显微镜进行形态学观察，通过观察假头基、背面、腹面、盾板、生殖孔、肛沟等进行初步鉴定。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1 蜱的DNA提取

将ddH2O吸干并将完整的虫体分别放置在新的1.5 mL离心管内，用消毒后的剪刀剪碎，分别加入200 μL缓冲液GA与20 μL蛋白酶K，将样品置于56 ℃的水浴锅里过夜消化。按照DNA提取试剂盒说明书提取虫体基因组DNA，所得DNA样品放在-20 ℃下保存。

1.5.2 蜱的PCR扩增及测序

参照文献[14]设计的引物进行蜱的分子鉴定，引物序列如表2所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。预计扩展片段长度为450 bp。扩增反应总体系为25 μL，其中 2×AccurateTaq预混液12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，超纯水8.5 μL，模板DNA为2.0 μL。扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min，16 ℃反应结束。同时设阴性对照。取5 μL的PCR产物于加入了核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中，置于电泳仪上电泳，检测结果可通过紫外透射仪拍照记录。将与目的片段大小重合的DNA样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序、拼接。序列拼接成功后于NCBI-BLAST网站上比对分析。从GenBank中下载部分与分离株相近的基因序列。利用MEGA 6.0软件，采用邻接法构建进化树，以环形扇头蜱(Rhipicephalusannulatus)作为外群，Bootstrap置信值重复抽样1 000次。

表2 引物序列

2 结果与分析

2.1 形态学观测

对采集的成蜱进行形态学初步观察，并与蜱分类检索表[15]进行比对，初步鉴定采集的样品均属扇头蜱属(Rhipicephalus)。虫体呈黄褐色的长椭圆形，背腹扁平，头、胸及腹合为一体，有假头和躯体2部分，有4对足，盾板长大于宽，上面富有对称性的花纹。气门板呈长圆形，肛沟明显，假头基呈六边形，且有缘垛，为扇头蜱属的典型特征(图1)。

a.雌蜱背面观；b.雌蜱腹面观；c.雄蜱背面观；d.雄蜱腹面观；e.雄蜱肛门及肛后沟；f.雌蜱肛门；g.假头基；h.足(部分)。图1 采集寄生蜱样品的形态学特征

2.2 微小扇头蜱coxⅠ鉴定

对455只蜱分别提取DNA，采用PCR技术扩增coxⅠ基因。结果扩增片段大小均约450 bp，部分PCR产物电泳见图2。

M.DNA Marker DL2000；1～5.阳性样品；6.阴性对照。图2 牛羊体表寄生蜱coxⅠ基因 PCR 扩增产物

2.3 序列测定及分析

测序结果表明，云南中部地区牛羊体表寄生蜱的coxⅠ基因序列长度为450 bp，BLAST比对结果显示样品与微小扇头蜱的相似性最高，达100%。序列中A、C、G和T碱基的平均含量为28.67%、13.65%、14.33%和43.35%，A+T的含量远高于G+C的含量。牛源蜱占比81.76%(372/455)，羊源蜱占比18.24%(83/455)。

利用MAGA 6.0软件构建进化树，结果显示本研究中的牛源微小扇头蜱RM1分离株以99%的置信度与云南地区的牛源微小扇头蜱分离株汇成一支。羊源微小扇头蜱RM2分离株与印度、巴基斯坦、孟加拉国和缅甸的微小扇头蜱分离株亲缘关系较近(图3)。

▲本研究分离株图3 微小扇小蝉coxⅠ基因片段进化分析

3 讨论

3.1 形态与基因比对鉴定

虫体假头基的形状是鉴定蜱种属的重要依据，扇头蜱属的典型特征为假头基形状呈六角形，且有缘垛，扇头蜱属下分为5个亚属78种，其中仅Rhipicephalus就达66种之多[16]。此外，扇头蜱属各类群间分类地位及系统进化关系比较复杂，起源和分化问题还需进一步验证[17]。本次研究通过对成蜱的形态学观察，再结合虫体的coxⅠ基因序列分析，对云南省的玉溪峨山县、玉溪元江县、昆明晋宁区、楚雄武定县、玉溪澄江县、普洱墨江县共计6个地区的牛羊采集的体表寄生蜱分析研究，发现获取的牛源蜱与云南牛源蜱(OM368329.1)汇聚同一分支[18]，表明本次研究所采集的牛源蜱为微小扇头蜱，获取的羊源蜱与印度、巴基斯坦、孟加拉国和缅甸的微小扇头蜱分离株汇聚，表明羊源蜱同属微小扇头蜱，且羊源微小扇头蜱与牛源扇头蜱之间可能存在交叉感染的情况。本次研究丰富了云南微小扇头蜱基因序列的资料，有利于微小扇头蜱的分子鉴定和遗传变异研究。

3.2 牛羊体表寄生蜱的种类与分布

牛羊体表常见寄生蜱以扇头蜱属、璃眼蜱属、血蜱属为优势属类[19]。其中，微小扇头蜱的宿主以牛为主，云南地区养殖的云岭牛、红安格斯牛、婆罗门牛都有感染微小扇头蜱的报道[20]。此外，羊、马、驴、犬、猫以及水鹿、青羊、鼠类等野生动物都可以作为该蜱的宿主。微小扇头蜱作为一种重要的人畜共患病原的传播媒介，主要分布于华中和西南地区，集中于海拔范围4 km左右的地区，潜在分布于我国665个县区，影响面积约135.7万km2，其生活范围主要适于气候温暖潮湿且温度季节性变化较小的南部地区，降雨量是影响其分布的主要因素[21]。亚红祥等[22]利用形态学观察结合分子鉴定的方法对1 874只蜱鉴定，发现云南四川交界处的滇西横断山区养殖家畜体表寄生蜱以微小扇头蜱为优势种，本次研究也表明云南部分地区牛羊体表寄生蜱为微小扇头蜱。因此，将来有必要对云南全省进行家畜体表寄生蜱的系统性调查和研究，以明确云南地区家畜体表蜱的种类与分布的变化情况，为其防治与研究提供理论和实践依据。

同时，由于蜱作为吸食血液为主的体表寄生虫，其所携带的病原数量较多，已报道存在斑点热群立克次体、无形体科病原体、巴贝斯虫等。尹传松等[23]在牛源微小扇头蜱中发现该类蜱携带牛巴贝斯、双芽巴贝斯等血液寄生性原虫。由蜱携带并传播的病原可导致人及家畜的血液性疾病如贫血、黄疸等，若病情严重可威胁家畜生命安全，应重视家畜寄生蜱的防控工作。

3.3 体表寄生蜱的防治

目前利用药物防治仍然是减少蜱寄生的重要措施[24]。云南自然资源富饶，植被类型丰富，特别是云南地区的亚热带高原季风气候夏无酷暑，冬无严寒，适宜蜱的生存，夏季又为蜱多生季节，各养殖户对家畜体表寄生蜱的防控更加要引起重视。姜在阶等[25]发现采自云南牛体表的微小扇头蜱饱血后平均可产2 647枚虫卵，其产卵能力与吸血量呈正相关且受温度影响较大。各牛羊家畜养殖户在养殖过程中应科学制定防虫除虫计划，对放牧牛羊开展轮流放牧，对圈养牛羊要及时清理阴潮的角落、缝隙，及时通风。同时避免家畜间蜱的相互传播，及时隔离出带虫个体，采用双甲脒、氰氟虫腙联合用药喷洒或洗刷畜体，可达到良好的预防和治疗作用[26]。近年来微小扇头蜱的生活范围有扩大的趋势，因此云南地区的养殖户需加强对微小扇头蜱的防控工作。