QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测猪肉中76 种兽药及其代谢物

吴彦蕾，苏 敏，周纯洁，田 圆，汪 敏

（重庆市食品药品检验检测研究院，国家市场监管重点实验室（调味品监管技术），重庆 401121）

我国是猪肉生产和消费大国，其质量安全问题主要来源于兽药残留[1-3]。长期食用兽药残留超标的猪肉，会造成人体内兽药蓄积，抑制人体的免疫功能，危害人体健康[4-6]。兽药种类繁多，结构多样，化学性质也存在较大差异[7-9]。目前的国标检测方法大多是测定某一种或某一类药物，在实际检测中往往需要反复取样，并采用不同的方法进行样品前处理，耗时耗力，无法实现对多种类兽药残留的同时检测，因而在发生食品安全突发事件时和应急保障工作中就显得力不从心[10-12]。因此，简便、快速、高通量、高灵敏度已成为未来兽药残留检测领域发展的趋势[13-15]。

近年来，快速、简便、便宜、高效、可靠、安全的QuEChERS 样品前处理方法结合高灵敏度、高选择性的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术已经开始应用于动物源性食品的兽药残留检测[16-20]，研究者通过不断改进净化方式和净化材料，对动物源性食品中的多种类兽药残留的测定进行了探索[21-22]。值得一提的是，兽药理化性质差异较大，色谱保留能力和溶解性也各不相同，采用QuEChERS技术净化后得到的溶液通常为高比例有机相，若直接进样容易出现不同程度的溶剂效应。许多研究者采用氮吹后高比例水相复溶的方式来减少溶剂效应，但往往一些弱极性的兽药又难以复溶。针对这一问题，本研究建立了一种基于化合物色谱行为和溶解性的集成化分类方式，以理化性质各异的18 种喹诺酮类、23 种磺胺类、10 种硝基咪唑类、9 种大环内酯类、16 种苯并咪唑类兽药及其代谢物作为研究对象，将这76 种化合物分为弱极性的Q1 组和强极性的Q2 组，选择猪肉为代表基质，采用QuEChERS 技术一步净化后分组进行UPLC-MS/MS 测定，既能解决弱极性化合物的溶解性问题又能减少强极性化合物的溶剂效应。该方法操作简便、快速、灵敏度和准确度高，有拓展更多类别兽药及其代谢物的潜力，为猪肉中多类别兽药残留检测提供了有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇中18 种喹诺酮类混标溶液、甲醇中23 种磺胺类混标溶液、乙腈中10 种硝基咪唑类混标溶液、甲醇中9 种大环内酯类抗生素混标溶液、甲醇中16 种苯丙咪唑类混标溶液 100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司；乙腈、甲醇 色谱纯，德国Merck 公司；甲酸 色谱纯，德国CNW 公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）（40～50 μm）、石墨化炭黑（GCB）天津Agela Technologies 公司；无水硫酸钠、无水硫酸镁 分析纯，重庆川东化工公司；聚四氟乙烯（PTFE）滤膜 0.22 μm，美国Agilent公司；实验用水 超纯水；猪肉样品 购自重庆市内超市及农贸市场。

QTRAP 5500 型三重四级杆/复合线性离子阱质谱仪 美国AB SCIEX 公司；Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪 美国WATERS 公司；VORTEX GENIUS3 型涡旋振荡仪 德国IKA 公司；Milli-Q 型超纯水机 美国Millipore 公司；MSE225P-ICEDU 型电子天平 德国Sartorius 公司；超声波清洗器 德国Elma 公司；MD200-2 型氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准中间溶液：分别准确移取1 mL 标准品，用乙腈定容至10 mL，得到10 μg/mL的标准中间溶液，-20 ℃避光保存。

混合标准工作溶液：分别移取1 mL 标准中间溶液，用乙腈定容至10 mL，得到1 μg/mL 混合标准工作溶液，4 ℃避光保存。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 样品提取 称取均质试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入2 mL 乙腈饱和的正己烷，涡旋混合30 s，再加入0.2%甲酸乙腈10 mL，涡旋混合30 s；加入6 g 无水硫酸钠后迅速振摇，涡旋1 min，37 kHz 超声提取15 min 后，以8000 r/min 离心5 min，待净化。

1.2.2.2 提取液净化 移取5 mL 提取液到含有500 mg无水硫酸镁和500 mg C18吸附剂的离心管中，涡旋1 min 后以8000 r/min 离心5 min。离心后取1 mL上清液经0.22 μm PTFE 滤膜过滤后供Q1 组目标化合物的测定；同时取2 mL 上清液在40 ℃下用氮气吹干，残渣中加入0.5 mL 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水（v/v，2:8），涡旋混匀后经0.22 μm PTFE 滤膜过滤，供Q2 组目标化合物的测定。

1.2.3 基质标准曲线的配制 称取7 份阴性猪肉样品各5 g，按“1.2.2”操作步骤进行后，得到空白基质溶液，分别加入混合标准工作溶液，配制成基质标准系列工作溶液。

1.2.4 仪器条件

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A 为0.1%甲酸乙腈，B 为0.1%甲酸水；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；Q1 组梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%～5% B；1.0～2.5 min，5% B；2.5～2.6 min，5%～90% B；2.6～4.0 min，90% B；Q2 组梯度洗脱程序：0～4.5 min，95%～85% B；4.5～6.0 min，85%～5%B；6.0～6.5 min，5% B；6.5～6.6 min，5%～95% B；6.6～8 min，95% B。

1.2.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；监测模式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：5500 V；气帘气（CUR）压力：35 psi；雾化气（GS1）压力：50 psi；辅助气（GS2）压力：50 psi；离子源温度（TEM）：550 ℃；76 种兽药及其代谢物的质谱参数见表1。

表1 76 种兽药及其代谢物的保留时间、母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量Table 1 Retention times,parent ions,product ions,declustering potentials (DPs),and collision energies (CEs) of the 76 veterinary drugs and their metabolites

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

由于部分磺胺类及硝基咪唑类化合物的极性较强，本研究选用对极性小分子保留性能优良的WATERS ACQUITY HSS T3 色谱柱进行色谱分离。考虑到样品前处理采用乙腈体系作为提取溶剂，本实验选择乙腈和水的混合体系作为流动相，并考察了流动相中引入pH 调节剂甲酸或离子对试剂乙酸铵对76 种兽药及其代谢物的色谱峰形及质谱响应的影响。结果表明，乙腈-水作流动相时，喹诺酮类和苯丙咪唑类化合物的色谱峰拖尾明显；乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作流动相时，喹诺酮类化合物峰形仍然不理想；0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈-含0.1%甲酸10 mmol/L 乙酸铵水溶液作流动相时，喹诺酮类和苯并咪唑类化合物的峰形均得到明显改善，说明流动相中引入甲酸可有效改善这两类化合物的峰形（图1）。但流动相中乙酸铵的引入会使得磺胺硝苯（SAN）的质谱响应降低1 个数量级以上（图2），因此本研究选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。考虑到磺胺类化合物有5 组同分异构体（磺胺醋酰/磺胺脒、磺胺恶唑/磺胺二甲异噁唑、磺胺二甲基嘧啶/磺胺二甲异嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶/磺胺对甲氧嘧啶/磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶/磺胺邻二甲氧嘧啶），实验采用先缓后陡的梯度洗脱程序，可以兼顾76 种化合物的峰形和质谱响应。

图1 流动相定容时76 种兽药及其代谢物的色谱图（50 ng/mL）Fig.1 Chromatogram of 76 veterinary drugs and their metabolites using mobile phase as solvent (50 ng/mL)

图2 不同流动相时磺胺硝苯的质谱响应Fig.2 Mass spectroscopic response of sulfanitran using different mobile phase

2.2 复溶液的选择

由于76 种兽药及其代谢物极性差异较大，因此样品前处理过程中复溶液的选择非常关键。本实验考察了76 种化合物的混合标准溶液（30 ng/mL）氮吹干后，分别用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水体积比为5:95、20:80、50:50、80:20 的溶液和0.1%甲酸乙腈复溶时各化合物的色谱行为，发现3 种喹诺酮类、4 种磺胺类、8 种大环内酯类、7 种苯并咪唑类共22 种化合物（Q1 组）无显著溶剂效应，而其它54 种化合物（Q2 组）在有机相占比越高时色谱保留能力越差。当有机相占比≤20%时，76 种化合物色谱保留效果较好，无显著溶剂效应。由图3 可见，复溶液中有机相占比越低，Q1 组化合物尤其是苯并咪唑类的峰面积越小，这可能是由于这些化合物极性较弱，复溶液中乙腈含量变低后对这些化合物的溶解能力变差。结果表明，即使含有相同官能团的同类别的兽药，其色谱保留效果和溶解性也存在较大差异，因此现行标准中同类别兽药同时检测的方法并不合理。

图3 Q1 组化合物在不同有机相占比溶液中的复溶效果Fig.3 Solubilization of group Q1 in solutions with different amount of organic phase

本实验根据色谱行为和溶解性将76 种兽药及其代谢物分为两组进行测定（Q1 组和Q2 组）：Q1 组为弱极性的22 种化合物，在色谱柱上保留较好，无显著溶剂效应，因而经提取净化后的样液即可直接测定；Q2 组为强极性的54 种化合物，溶剂效应较强，样液需经氮吹后用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（v/v，2:8）复溶后测定。此外，由于Q1 组化合物在色谱柱上普遍保留较强，按照2.1 优化出的梯度条件洗脱后保留时间均集中在6.0～6.5 min。为节省分析时间，本研究采用更陡的梯度程序洗脱Q1 组的22 种化合物，见图4。

图4 0.1%甲酸乙腈定容时Q1 组化合物色谱图Fig.4 Chromatogram of compounds of group Q1 in acetonitrile with 0.1% formic acid

2.3 提取溶剂的优化

乙腈和甲醇是兽药残留检测中常用的提取剂，乙腈与甲醇相比渗透性更强且沉淀蛋白的效果更好，因此本实验选择乙腈作为主要提取溶剂。考虑到多数化合物含碱性基团，适量添加甲酸可以提供酸性环境，与目标化合物结合成盐从而提高提取效率，本实验考察了乙腈和0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%甲酸乙腈作为提取剂时，猪肉基质中Q1 组和Q2 组化合物的平均回收率（图5a 和图5b）。实验发现，当采用小于0.2%的甲酸乙腈提取时，可提高各类化合物的平均回收率，这可能是由于甲酸的加入提高了各化合物在乙腈中的溶解度[23]；当采用大于0.2%的甲酸乙腈提取时，除喹诺酮类以外，其它4 类化合物的平均回收率逐渐下降，这可能是由于甲酸含量的增加提高了提取剂对基质的渗透作用，使得更多的共提物进入到提取液中造成基质干扰，降低了化合物的离子化效率[24]；其中Q2 组的磺胺类平均回收率下降最明显，当采用5%甲酸乙腈提取时，平均回收率低至13.7%，较0.2%甲酸乙腈提取时降低了80.4%，这可能是由于氮吹导致磺胺在过高的酸性环境下发生了一定程度的损失[15,23]。从图6 可以看出，当采用0.2%甲酸乙腈作为提取剂时，回收率在60%～120%范围内的化合物最多。因此本研究最终选择0.2%甲酸乙腈作为提取剂。

图5 不同提取剂时76 种兽药及其代谢物的平均回收率Fig.5 Average recoveries of 76 veterinary drugs and their metabolites with different extraction solvents

图6 不同提取剂时各回收率范围内的化合物数量Fig.6 Number of compounds in each recovery range with different extraction solvents

2.4 净化条件的优化

QuEChERS 方法常用的吸附剂主要有PSA、C18和GCB，PSA 可用来去除有机酸、糖类等极性干扰物，C18能够吸附脂肪、磷脂等非极性杂质，GCB 对平面结构分子有很强的亲和性，能有效去除色素和甾醇。由于PSA 对喹诺酮类和磺胺类存在吸附作用[25-28]，本实验选择C18和GCB 考察猪肉基质中76 种兽药及其代谢物的回收率，发现样品提取液经GCB 净化后，磺胺硝苯、苯硝咪唑、螺旋霉素、替米考星以及18 种喹诺酮类和16 种苯并咪唑类化合物回收率均低于20%。因此，本研究选择C18作为吸附剂。

实验考察了使用50、100 和200 mg/mL C18吸附剂时76 种兽药及其代谢物的回收率，发现各化合物的回收率均无显著变化。然而，猪肉样品基质复杂，采用0.2%甲酸乙腈提取时容易共提出大量的磷脂，造成污染仪器，降低色谱柱寿命。因此，本实验进一步比较了不同用量C18吸附剂对猪肉样品提取液中磷脂的净化效果。将液相色谱柱替换为双通接头后，以猪肉中最为常见的磷脂酰胆碱（PC）作为代表磷脂，选择PC 的特征碎片离子m/z 184 进行母离子扫描得到总离子流图[29]。由图7 可见，采用C18吸附剂净化后，无论是直接测定还是氮吹后复溶再测定，PC 峰均明显降低，且出峰时间越靠后的PC 峰降低越明显。图7c 和图7f 表明，0.9 min 左右的色谱峰高均随着C18吸附剂用量的增加逐渐下降；采用Q1 组的直接测定法，当C18吸附剂的用量≥50 mg/mL时峰高变化不明显；采用Q2 组的氮吹后测定法，当C18吸附剂的用量≥100 mg/mL 时峰高变化不明显。因此，本研究确定每1 mL 样品提取液中C18吸附剂的用量为100 mg。

图7 按照Q1 组和Q2 组样品前处理操作时猪肉基质提取液净化效果Fig.7 Purification effect of the extract solution from pork when using sample pretreatment of group Q1 and Q2

2.5 基质效应

基质效应是样品离子化时样品基质与目标化合物相互竞争电离而导致目标化合物的响应强度发生不同程度增强或减弱的现象。按照公式：基质效应（ME，%）=（样品基质中添加相同含量化合物的响应值/纯溶剂中化合物的响应值-1）×100，计算76 种兽药及其代谢物的基质效应，ME 为正值表示增强的基质效应，负值表示抑制的基质效应，绝对值越大表示基质效应越强[30]，见表2。76 种兽药及其代谢物中有3 种喹诺酮类、1 种磺胺类、6 种大环内酯类、3 种苯并咪唑类化合物基质效应的绝对值高于20%，说明猪肉基质复杂，即使采用QuEChERS 技术净化后仍然对部分化合物存在较强的基质效应。因此，本研究采用空白基质标准曲线定量来校正基质效应。

表2 76 种化合物的回归方程、相关系数、定量限、加标回收率、相对标准偏差和基质效应（n=6）Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r),limits of quantitations (LOQs),spiked recoveries,RSD and Me of the 76 compounds (n=6)

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围与检出限 采用阴性猪肉样品制备空白基质标准曲线，按优化的实验条件进行测试，以目标化合物定量离子的峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x，ng/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到76 种兽药及其代谢物的线性回归方程和相关系数，如表2所示。结果表明，76 种化合物在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数r 均大于0.995，按照定量离子信噪比（S/N）≥10 时计算定量限（LOQ），76 种化合物的定量限（LOQ）均低于10 μg/kg。

2.6.2 回收率及精密度 在阴性猪肉样品中添加三个浓度水平的标准溶液，分别进行6 次平行实验，考察76 种化合物的加标回收率和精密度。结果表明，76 种化合物回收率范围在61.3%～96.2%之间，相对标准偏差（RSD）在2.0%～14.6%之间，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 中对回收率及精密度的要求，可满足日常检测需要。

2.7 实际样品测定

采用本研究建立的方法，对170 批次猪肉样品进行全面筛查，其中23 批次样品检出5 种兽药残留量超出GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定限量。与现行国家标准方法进行比较，实验结果采用配对T 检验方法进行分析，结果显示5 个项目P>0.05，差异无统计学意义，因此认为两种方法检测结果无显著性差异，详见表3。

表3 本方法与国家标准方法比较Table 3 Comparison between established method and the state standard methods

3 结论

本研究结合QuEChERS 样品前处理技术和UPLC-MS/MS 技术，建立了可同时检测猪肉中性质各异的5 类76 种兽药及其代谢物的方法。根据化合物色谱行为和溶解性，将76 种兽药及其代谢物进行集成化归类，分为弱极性的Q1 组22 种化合物和强极性的Q2 组54 种化合物，以猪肉为代表基质，采用一步净化后分组测定的方式，既能解决弱极性化合物的溶解性问题又能减少强极性化合物的溶剂效应。在优化的色谱质谱条件以及样品前处理提取、净化和复溶条件下，该方法测定76 种化合物回收率范围在61.3%～96.2%之间，相对标准偏差（RSD）小于15%，LOQ 小于10 μg/kg，可满足猪肉中多类别兽药残留同时检测的需要。