不同质地植烟土壤细菌多样性对生物有机肥的响应

张 倩, 赫英宇, 王 波, 郭 慧, 孙军伟, 杨惠娟

(1.河南农业大学烟草学院,河南郑州 450002; 2.黑龙江省烟草公司牡丹江烟叶公司,黑龙江牡丹江 157011;3.湖北中烟工业有限责任公司,湖北武汉 430077; 4.云南省烟草公司大理州公司,云南大理 671000)

土壤中存在着许多微生物,这些微生物在土壤中的适应性是有差别的[1],土壤 pH值、质地、养分、水分和温度都会对土壤中的微生物进行调控[2]。微生物多样性、土壤呼吸和微生物生物量等生物因子对土壤健康起着重要作用,微生物肥料的作用是通过微生物的生命活动,可以使多种营养物质之间相互补充,并在一定程度上改善了土壤的结构。微生物群落结构的差异性与土壤类型密切相关,土壤微粒的细致程度与有机质含量和微生物变化的缓冲能力成正比关系,而与微生物群落结构的变化成反比关系[3]。壤土、黏壤土、黏土在门层次上微生物群落构成相似,但丰度有一定差异;3种质地土壤的菌类成分及相对富集程度均无显著差异[4]。

烟草作为我国最重要的经济作物之一,合理种植可以提高产量,增加农民收入[5],肥料的合理施用在一定程度上决定着作物的成长[6]。在烟叶种植中,为了提高产量,大量施用化肥、农药,引起土壤退化,从而导致作物产量的降低[7-9]。因此,如何选择适宜的有机肥改善土壤问题,提高作物产量,是目前的研究热点[10]。据报道,土壤微生物的多样性和活力对肥料的反应机理是比较复杂的,土壤微生物的多样性活力受多种因素影响,不同的肥料也会对土壤产生不同的影响[11]。土壤微生物种类、数量及其变化是土壤有机质矿化速率和多种营养物质分布状况的一个重要指标,能够直接影响土壤的供肥状况[12]。而土壤深度、土壤质地对培肥效果的影响更为明显[13]。

不同的施肥处理对土壤的影响是显著不同的,目前已有的一些研究表明,肥料的作用是通过提高土壤中的糖类和苯酚类物质含量作为碳源,从而达到调控或缓解连作对烟草生长的作用[14];研究贵州植烟土壤得出,长期施用有机肥能提高该区土壤有机质含量和改良土壤微生物群落[15];研究表明,在施肥前期,土壤中的微生物群落结构变化显著,而在后期则无显著变化[16-20]。施肥促进土壤中微生物群落的活性和多样性[21]。因此,通过分析不同质地土壤秸秆还田配施腐熟剂的土壤细菌优势菌群,可为在不同质地的土壤中选择腐熟剂提供一定有价值的参考。

宏基因组是指利用特定环境中所有微生物的基因组进行基因序列分析,从而解决了常规方法无法获得完整的土壤微生物信息的不足[22]。通量大、可扩展性好、费用低、技术快速、准确率高等是第二代高通量测序技术的特点,能为土壤微生物群落提供良好的信息[23]。利用高通量 Illumina Miseq技术可对烟叶根际土壤中的微生物多样性和细菌群落结构进行较为全面的分析[24]。据了解,不同质地土壤细菌多样性差异研究较多,而细菌多样性对有机肥的响应研究较薄弱[25]。本研究通过运用高通量测序技术研究了连作条件下不同施肥处理对云南大理植烟土壤微生物群落结构多样性及改良土壤环境的影响,旨在为生物有机肥的合理配施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在云南省大理州弥渡县红岩镇西双村进行(25°23′8″N,100°24′23″E,海拔1 729.5 m,中亚热带季风气候区),年均气温17.3 ℃,年均降水量824.4 mm。土壤类型为2种,分别是中壤土、轻壤土,试验烟田为多年连作。本试验所用的2种质地(轻壤土D1、中壤土D2)的土壤理化性状见表1。

表1 不同质地土壤理化性状

1.2 试验设计

大田试验采用田间小区试验,在选定的轻壤土(D1)、中壤土(D2)试验地实施化肥与不同种类有机肥配施试验,本试验设置了6个不同的处理,并且采用随机区组设计。D1设置3个处理,分别为T1:在轻壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常规施肥;T2:在轻壤土中,起垄前条施国发商品有机肥100 kg/667 m2,其他按照常规施肥(有机肥对照);T3:常规施肥(常规对照)。D2设置3个处理,分别为T1:在中壤土中,移栽前塘施三炬微生物菌肥50 kg/667 m2,其他按照常规施肥;T2:在中壤土中,起垄前条施国发商品有机肥 100 kg/667 m2,其他按照常规施肥(有机肥对照);T3:常规施肥(常规对照)。试验处理见表2。使用大理烟草公司提供的烟草专用复合肥为对照,总养分≥44%,N、P2O5、K2O含量分别为10%、10%、24%。每个试验设置3次重复,行距和株距分别为120 cm和60 cm,四周设保护行。试验处理均施用烟草专用肥40 kg/667 m2。烤烟品种为红花大金元,各处理间的田间管理措施都按照当地优质烟叶生产技术标准进行。

表2 大田试验处理

大田试验于2019年4月22日开始,2019年10月结束。还苗期是4月26日至6月2日,团棵期是6月3—13日,旺长期是6月27日,现蕾期是6月28日至7月5日,成熟期是7月6日至8月31日并且收获完毕。

福建三炬固体微生物菌肥处理T1施肥方式为窝施;弥渡国发有机肥处理T2施肥方式为条施;肥料:弥渡国发有机肥、福建三炬固体菌肥的技术指标等见表3。

表3 2个肥料的技术指标及生产厂家

1.3 测定项目与方法

在烟株处于团棵期(T)、旺长期(W)、第1次采收前(C1)、第2次采收前(C2),采集烟株根部 10 cm 处的根际土壤,取样方法为五点取样法,分别对相同处理后的土样进行混合均匀,再按照四分法对所取样品进行取样,称取100 g土样,并用灭菌过的自封袋装好,然后进行土壤总 DNA提取、库构建、测序等工作。

1.4 测序数据预处理与分析

1.4.1 数据质控 将 DNA上样于1%的琼脂糖凝胶孔内,用120 V恒压电泳法进行15 min的检测,并在紫外线和透射光下进行观察,用于查看DNA的完整度和浓度。PCR引物如下:前端引物343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′;后端引物:798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′[26]。对原始数据进行拼接 (FLASH,version 1.2.11),然后对拼接后的序列进行质量过滤,消除嵌合体(UCHIME,version 2.4.2),从而获得高品质的 Tags序列。用TruSeqTMDNA Sample PrepKit构建PE文库,在Illumina Miseq平台上进行序列分析。

1.4.2 生物信息学分析 高通量的排序结果是最初的双端序列,也就是所谓的数据;接着,采用 Trimmomatic (版本0.35)软件[27],首先用滑动窗口法扫描 raw数据,当质量小于20时,删除具有低于阈值的碱基质量平均值的滑窗,而长度小于50 bp的序列被淘汰[28];然后,利用 Flash[29]软件(版本1.2.11),将上一步的标准双端数据进行拼接,得到了最大长度200 bp的序列,从而得到完整paired序列;在 QIIME中将包含N个碱基的序列用split_libraries (version1.8.0)删除,将单个碱基重复数大于8的序列剔除,再剔除长度小于200 bp的序列,得到一个 clean tags序列;然后,利用 UCHIME (version 2.4.2)来移除 clean tags中的嵌合体,最后获得 OTU分区的valid tags;并利用欧易自己编写的程序对质量控制进行了统计,得出了相应的数据。

1.4.3 数据分析 数据分析采用微软 Excel 2016进行,方差分析采用 SPSS 22软件对数据进行分析,采用Duncan’s多重检验方法对各处理在0.05水平进行了差异显著性检验。使用Canoco 5.0软件对土壤中的细菌属和养分进行 DNA分析,通过热图对各菌种或样本量的丰度相似程度进行聚类,将20个主要菌群按门类划分,并采用不同的颜色和长度来表示细菌群落成分的差异和比例,利用 UPGMA技术对样本进行了丰度相似度的聚类分析。应用 SPSS 19.0对各处理间各因子进行了方差分析,并进行了统计学上的显著性分析。其中,功能多样性指数为Simpson指数、Goods Coverage指数、Chao指数、Shannon-Wiener指数。

Chao指数估算了该群落中的种群数量[30]:

式中:Sobs表示实际测量出的OTU数目;n1表示仅包含1条序列的OTU数量;n2表示仅包含2条序列的OTU数量。

香农指数(Shannon-Wiener指数)包括了2个部分,一是物种数量,二是不同个体之间分布的均匀性。Shannon 指数计算公式:

式中:Ni表示含有i条序列的OTU数目;N表示所有的序列数。

辛普森指数(Simpson指数)是一种常见的群落多样性指标,由Simpson提出[31],是指2个被随机选择的个体,属于不同种类的可能性。辛普森指数愈高,说明群落的多样性愈高。

Goods Coverage指数也是一种多样性指数,由Esty最先提出[32]。指数越接近1,表明序列的深度基本覆盖了样品的全部类型。

式中:Cdepth表示测序的深度。

2 结果与分析

2.1 测序序列数据统计

项目共72个样本,每个样本重复3次,经分析,所有处理的测序结果均已达标,可以用于后续分析。用97%的相似度来进行聚类,获得了 8 781 个 OTU,在质控后,Clean Tags的分布范围为22 443.00～50 078.33,除掉嵌合体之后获得valid tags(也就是最终要分析的数据),在 19 510.33～45 413.67 bp之间,valid tags的平均长度为427.97～431.40 bp,而各个样品的 OTU数量在 1 277.33～1 951.33之间(表4)。

表4 植烟根际土壤微生物OTC数量

总体上,测序包含了烟叶的整个生命周期,因此土样测序的整体趋势为烟叶第1次采收(C1)>烟叶第2次采收(C2)>旺长期(W)>团棵期(T);并且在各个时期地块D1整体序列高于地块D2。其中在团棵期间,施用微生物菌肥的处理T1高于其他处理,施用国发有机肥的处理T2次之,常规施肥T3最少,但是T3的有效序列所占百分比最高;在旺长期间,施用T2处理最好,T1处理次之,T3最弱;在采收期间,常规施肥T3处理最好,但差距不大;可知在常规施肥的条件下加施肥料,可以增强烟叶前期土壤微生物的活跃。

2.2 植烟土壤的稀释曲线

稀释曲线中曲线能否达到平台期可以说明测序数据能够覆盖微生物群落的多样性。图1中对72个植烟土壤进行测序,其中1条曲线表示1个样品,横坐标是随机取样的深度(也就是取样的序列数),而纵坐标是指数值。当测序数目达到1 700以后,细菌稀释曲线趋于平缓,这就说明此样本的测序结果是正确的,而更多的样本中可能会有少量的新的OTU,反之,若继续进行测序,将会产生更多的新的 OTU。

2.3 植烟土壤的Alpha 多样性分析

Alpha多样性分析又称为生物境内的多样性,它是用不同的 alpha多样性指数来评估样本中的物种丰富程度和分布均匀程度。由表5可知烟草根际土壤样本Alpha多样性统计结果。试验结果显示,该试验所建的土壤微生物库覆盖范围均在80%以上,反映了该地区土壤微生物多样性的真实、有效性,有一定的应用价值;总体香浓指数高于8,表明烟草根际土壤样品的细菌群落多样性较高,土壤中的细菌种类较多,并且在采收期间细菌多样性更为丰富。在各个时期中可以看出地块D1与地块D2差异不明显,其中施用微生物菌肥的土壤中细菌含量最大,施用国发有机肥的土壤中细菌含量次之,常规施肥含量最小;而Simpson指数值越大,生物多样性越低,图中可知施用微生物菌肥的处理Simpson指数最小,因此其生物多样性越多;群落丰富度的增高随着Chao指数增加而增加,呈正相关;不同土壤样本之间生物多样性指数存在差异,施用微生物菌肥的土壤的香浓指数、Chao1 指数均高于其他处理,Simpson指数低于其他处理,结果表明,施用微生物菌肥的土壤生物多样性相比更为丰富,其原因可能在于微生物菌肥的应用有利于微生物的生长。

表5 不同施肥处理下植烟土壤的Alpha 多样性分析

2.4 烟草根际土壤细菌在门水平上的分布

土壤中的微生物群落分布较为稳定,各菌种间的稳态分布特征相互影响,从而为土壤提供了有利的生态条件。在 OTU物种注释结果的基础上,选择了10个各样本丰度最好的物种,并且根据这10个物种完成了相对丰度柱状累积图的绘制。根据图2可以得到,OTU注释统计聚类到16个门,变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门 (Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门 (Chloroflexi)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、蓝细菌(Cyanobacteria)在各组样品中是优势菌门。

其中变形菌门的丰度含量最高(39%～63%),其次是放线菌门(15%～23%)和芽单胞菌门(4%～13%),相对百分比之和为97.56%。从整体看,烟株整个生长期间,丰度最活跃的变形菌门趋势为团颗期(T)>旺长期(W)>采收期(C),放线菌门以旺长期最为活跃,芽单胞菌门在采收期相对活跃,并且在团颗期施加微生物菌肥的处理T1的变形菌门相对丰度>对照,这就说明施加微生物菌肥在烟叶生长团颗期间发挥效用最强;从地块来看,各组样品优势菌门丰度趋势为地块D1>地块D2,在团颗期最为显著;在中壤土中施用微生物菌肥的处理在采烤第1次前(即D2-T1-C1)拟杆菌门、厚壁菌门丰度比例明显高于其他样品;而酸杆菌门、芽单胞菌门丰度比例低于其他处理。值得关注的是,绿弯菌门在轻壤土中采收期间施加微生物菌肥的处理中显著增加。

2.5 烟草根际土壤细菌在属水平上的分布

在OTU物种注释结果的基础上,选择了10个各样本属水平上丰度最好的物种,并且根据这10个物种完成了相对丰度柱状累积图的绘制。根据图3可以得到,OTU注释统计聚类到31个属,其中罗丹杆菌属(Rhodanobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、双子星菌属(Gemmatimonas)、丘氏杆菌属(Chujaibacter)、诺卡德菌属(Nocardioides)、假杆菌属(Pseudarthrobacter)、马尔莫里科拉菌属(Marmoricola)、芽孢杆菌属(Bacillus)、苔藓杆菌属(Bryobacter)、链霉菌属(Streptomyces)是各组样品中的优势菌属。其中丰度含量相对最高的是落单杆菌属(1%～30%),其次是鞘脂单胞菌属(0.7%～9%)和双子星菌属(0.3%～5%),从整体看,在烟株整个生长期间,丰度最活跃的落单杆菌属趋势为团颗期(T)>旺长期(W)>采收期(C),罗丹杆菌属以团颗期最为活跃,鞘脂单胞菌属在各个时期稳步增长,双子星菌属在采收期相对活跃,并且在团颗期施加国发商品有机肥的处理T2的落单杆菌属相对丰度>施加微生物菌肥的处理T1>对照,这就说明施加菌肥在烟叶生长团颗期间可以发挥效果;从地块来看,各组样品优势菌属丰度趋势为地块 D1>地块D2,在团颗期最为显著,说明中壤土配施中菌肥使土层细菌结构发生明显变化。

2.6 热图

在对 OTU序列进行注释后,用 Hatmap表示,并利用热图的色彩梯度和相似性差异,可以清楚地观察到不同的样品之间的差异,进而进行分析。

从颜色方面的reads数目看,植烟土壤微生物菌类随着时间的延长而增多,且丰度比较强。烟株生长期间,植烟土壤微生物菌类在各个时期丰度不同,在团颗期、旺长期间罗丹杆菌属、丘氏杆菌属、类诺卡氏菌属(Nocardioides)丰度显著,而在采收期双子星菌属、东加菌属、Ellin6067、Pseudolabrys、Bradyrhizobium丰度显著;整体上施用微生物菌肥的处理T1相对于对照组CK增加了丰度。施用国发有机肥的处理T2的微生物菌类丰度较弱(图4)。

3 讨论

施用微生物菌肥能显著增加土壤中的细菌Shannon指数和Simpson指数,与杨昊等的结果[33]相吻合。本研究通过施用微生物菌肥,对种植烟株不同时期土壤中的细菌多样性进行了研究。试验结果发现,不同质地的土壤细菌群落中Simpson指数和Shannon指数有明显的差异,说明施用微生物菌肥后的土壤相比对照土壤中的细菌群落多样性增高,且差异显著。

不同质地的土壤中,细菌的物种分布和多样性丰富程度存在差异;不同土壤类型、不同深度对微生物群落的结构和成分有显著的影响。土壤的各种特性决定了土壤微生物群落的多样性[34-38],不同的施肥处理对土壤微生物有不同的影响,施用微生物菌肥的烟叶通过根际分泌物对根际微生物群落的结构和成分构成有一定的影响。本研究对10种主要菌门进行了分析,结果表明:变形菌门、放线菌门、芽单胞门、拟杆菌门和酸杆菌门为优势菌门,这一结果与多数学者的研究结果相一致。变形菌门是土壤微生物中最重要的一类,其代谢活动是微生物活动的主体,是构成土壤微生物的重要组成部分,而且在土壤中比较稳定。云南大理烟草连作中壤土和轻壤土中,相对丰度最高的土壤细菌是变形菌门,第二和第三分别是放线菌门和芽单胞菌门;中壤土、轻壤土配施三炬微生物菌肥以及国发有机肥改变土壤优势菌种;中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏杆菌属丰度,丘氏杆菌属在各个时期均是土壤中主要细菌类群,说明其在烟叶的生长中起着重要作用。丘氏杆菌属具有较高的代谢能力,并且生理特性多功能,在环境保护方面具有一定的发展前景。中壤土配施国发有机肥后增加了罗丹杆菌属相对丰度;试验土壤样品中的主要细菌群落动态变化表现为:罗丹杆菌属、鞘脂单胞菌属、双子星菌属和丘氏杆菌属等,数量最多的是罗丹杆菌属,并且种类丰富,为优势菌株;本研究中中壤土配施微生物菌肥增加了丘氏杆菌属丰度,丘氏杆菌属在各个时期均是土壤中主要细菌类群,说明其在烟叶的生长中起着重要作用。中壤土配施国发有机肥后增加了罗丹杆菌属相对丰度,微生物菌肥和国发有机肥含有绿色木霉和丝状菌,对纤维素的分解能力较强,土壤施入微生物菌肥后,土壤中的细菌、真菌各菌种间的良性效应得到了明显的改善,同时还表现出了一种与土著菌的竞争和协同效应。

4 结论

本研究中,不同质地下活跃的微生物菌门都为变形菌门;中壤土微生物菌肥中重要作用的微生物类群为鞘脂单胞菌属;而轻壤土重要作用的微生物类群为罗丹杆胞菌。中壤土施用国发有机肥、微生物菌肥土壤细菌多样性差异不明显,但较常规施肥土壤细菌多样性差异明显;轻壤土配施中微生物菌肥细菌多样性差异明显。因此,综合试验来看,不同质地施用肥料对土壤细菌多样性差异明显,施用肥料可在不同程度上改善植烟土壤,但应因地制宜施用微生物菌肥。