不同豆角品种生长期及发芽处理对其皂苷含量的影响

管婷婷，寇 宇，张一婷，刘大军，宋 永，孙庆申,

（1.黑龙江大学生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，黑龙江省普通高校微生物重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080；2.河北环境工程学院，河北省农业生态安全重点实验室，河北秦皇岛 066102；3.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150080）

油豆角是我国东北地区（黑龙江、吉林为主）特有的一种优质菜豆品种[1]，富含蛋白质、胡萝卜素，营养价值高，口感好，具有促进胃肠蠕动、健脾补肾等功效。此外，油豆角中还含有皂苷类物质，主要为三萜类皂苷[2]。三萜皂苷主要通过乙酸/甲羟戊酸途径合成，一般可划分为3 个阶段：合成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；由异戊烯基转移酶和萜类环化酶催化IPP 和DMAPP 形成2,3-氧化鲨烯；2,3-氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化修饰后最终形成三萜类皂苷[3-5]。

油豆角中皂苷主要由三萜皂苷元与糖组成，常见的糖有葡糖糖、半乳糖、鼠李糖等[6]。目前，采用超声波辅助法[7]、正丁醇萃取[2]等方法来提取油豆角中皂苷，具有效率高、操作简便、避免溶剂损失等特点。研究表明，品种、生长周期、生长部位等客观条件会使油豆角等植物中皂苷含量发生改变[1]。这些皂苷具有多种重要的生物活性和广泛的药理作用，如降血脂、降血糖、抗癌、抗炎、抗过敏、抗氧化、治疗白血病、抗病毒、防治心脑血管疾病等[6,8]。在生产生活中常被用于制作清洁剂、发泡剂和乳化剂等[9]。因此，对油豆角中皂苷类物质的开发具有重要的价值。

本文以东北油豆角为原料，分析不同时期豆荚及种子的皂苷含量，明确豆角皂苷含量与生长期的关系及存在的部位；对发芽联合盐胁迫后豆角种子皂苷含量的变化进行测定，探究豆角种子通过发芽联合盐胁迫处理后皂苷含量变化。利用UHPLC-Q-TOFMS 得到的精确相对分子质量，对照文献数据库，对豆角中的皂苷类成分进行鉴别，为开发油豆角深加工产品种类提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆角（金冠、绿冠、盛冠、紫冠、青冠、满堂彩、哈15 号）均摘自黑龙江大学呼兰校区园艺基地；人参皂苷Rg1 标准品 上海创赛科技有限公司；氯化钠、冰醋酸、香草醛、高氯酸 均为分析纯，天津科密欧试剂有限公司；AM-P996 型Parafilm 封口膜无锡德凡仪器有限公司。

A560 型双光束紫外可见分光光度计 翱艺仪器上海有限公司；DZKW-D-2 型恒温水浴锅 天津天泰仪器有限公司；SB-5200DT 型超声波清洗机信仪仪器有限公司；FW100 型高速万能粉碎机 天津泰斯特有限公司；Agilent1290-G6470 型三重四极杆液质联用仪 上海安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 在2022 年6～8 月于黑龙江大学呼兰校区采摘金冠、绿冠、盛冠等7 个品种东北油豆角，在开花10～40 d 内每间隔五天采样，每个品种各取样100 g，平行取样三份，在采摘过的植株上挂签，实现对同株豆角在不同生长期进行采摘跟踪。

1.2.2 豆角总皂苷的提取、含量测定

1.2.2.1 原料制备 开花后10、15 d 的豆角，因种子较小，难以分开，所以这两个时期测定的是整个豆角中皂苷的含量；对开花后20 d 及以后的豆角，取不同生长期新鲜豆角的豆荚和种子剥离，置于60 ℃烘箱内烘干至恒重，用高速万能粉碎机将其分别粉碎，过80 目筛备用。

1.2.2.2 豆角总皂苷的提取 参照刘宁等[7]的方法，采用超声辅助提取法提取豆角总皂苷。准确称取1 g 豆角粉末于烧杯中，加入15 mL70%乙醇溶液，用封口膜密封后放入超声波清洗机中进行超声辅助提取，提取时间为25、30、35、40、45 min，温度为45 ℃，功率240 W，频率40 kHz，得到皂苷粗提液，过滤至澄清备用。

1.2.2.3 标准曲线绘制 参照张慧颖等[10]的方法，利用人参皂苷Rg1 绘制标准曲线，取不同量的人参皂苷标准溶液（400 mg/L）于60 ℃水浴干燥。加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加入0.8 mL 高氯酸，混匀后移入10 mL 比色管中，60 ℃水浴加热15 min，取出。静置冷却40 min，使用冰醋酸定容，摇匀后。以1 cm 比色皿于545 nm 波长处测定其吸光度。以皂苷质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制人参皂苷Rg1 标准曲线方程如下：Y=2.3223X-0.0075（R2=0.9965）。

1.2.2.4 样品中皂苷含量测定 准确吸取1 mL 皂苷粗提液于蒸发皿中，按照标准曲线的制备过程，在545 nm 波长处测定其吸光度，总皂苷含量计算公式如下：

式中：C 为由提取液吸光度值代入标准曲线回归方程得出的总皂苷质量（mg）；m 为豆角粉末质量（g）；Vm为样液定容后体积（mL）；V0为测定所用样液体积（mL）。

1.2.3 添加氯化钠对豆角种子发芽过程中皂苷含量的影响 参照赵露等[11]的方法，对金冠、满堂彩种子进行发芽处理。取一定量豆角种子，清洗后用蒸馏水浸泡过夜，将纱布平铺于培养皿的底部，每皿摆放100 粒精选种，加入适量蒸馏水或不同浓度的氯化钠（0.4%、0.8%、1.2%），在28 ℃恒温培养箱中培养至漏出白芽，并选取发芽1～4 d 的种子，测定皂苷含量，每个样本做三个平行。

1.2.4 UHPLC-Q-TOF-MS 分析金冠豆角粒中皂苷的种类

1.2.4.1 待测液制备 参照侯亚楠等[12]的方法，准确称取1 g 豆角粉末置于100 mL 烧杯中，加入15 mL 70%甲醇，45 ℃、功率240 W、40 kHz 超声提取35 min，提取液用0.22 μm 膜过滤后供检测分析。

1.2.4.2 色谱与质谱条件 测定仪器为三重四极杆液质联用仪，该系统配备Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸/水（A）和乙腈（B）。简化洗脱条件为10%乙腈至100%乙腈5 min线性梯度洗脱。柱温25 ℃，流速0.4 mL/min，进样量1 μL。电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometric，ESI-MS）分析，采用电离电压3500 V，源温度350 ℃电喷雾电离；氮气35 psi，气体流速10 L/min，负离子模式下对m/z 44 到m/z 1004 进行全扫描（MS2scan）在选择离子监测（selected lon monitoring，SIM）检测方式下，检测提取物的分子离子。在碎片离子扫描方式下，检测提取物的碎片离子。

1.3 数据处理

使用Origin 8.0 软件对试验所得结果进行统计学分析，P<0.05 表示差异显著，所有数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同生长期及品种豆角皂苷含量测定

由于开花后10～15 d 表现为豆粒不饱满，豆荚太小，因此在这两个生长期没有进行荚皮及种子分别提取，只对整个豆角进行皂苷含量测定，不同豆角在开花后10、15 d 时皂苷含量的动态变化见表1。其中，绿冠、盛冠、紫冠、满堂彩随生长周期的增加皂苷含量逐渐升高，金冠、青冠、哈15 号皂苷含量下降。

表1 不同豆角在开花后10、15 d 时皂苷含量的动态变化Table 1 Changes of saponin contents in different beans at 10,15 d post blooming

图1 是豆角开花后20～40 d 豆荚和豆角粒中皂苷含量的动态变化，金冠、绿冠豆角种子皂苷含量都在20 d 便达到最高值，但金冠和绿冠种子荚皮中皂苷含量分别在30 d 和20 d 时达到峰值，且豆粒中的皂苷含量显著高于荚皮（图1A，图1B）。盛冠和青冠种子和荚皮皂苷含量在25 d 时显著高于其它生长期，但盛冠和青冠种子荚皮中皂苷含量分别在25 d和35 d 时达到峰值（图1C，图1D）。紫冠、哈15 号种子皂苷含量在30 d 时含量显著高于其它生长期，但紫冠和哈15 号种子荚皮中皂苷含量分别在25 d和20 d 时达到峰值（图1E，图1F），满堂彩种子和豆荚中皂苷含量均在第35 d 达到最高值（图1G）。

图1 7 个品种豆角不同生长期种子及荚皮皂苷含量Fig.1 Contents of saponin in seeds and pods of seven varieties of Phaseolus vulgaris in different growth periods

本研究结果中，豆角总皂苷含量在不同部位不同生长期差别较大，种子中皂苷含量高于荚皮含量，皂苷含量都随豆角生长先增加后降低，以20～35 d 采收质量较好。李启照等[13]研究发现女贞不同药用部位不同生长期薯蓣皂苷元含量有所不同。徐伟等[14]研究发现随着生长时间的延长，美国皂荚壳皂苷的含量逐渐增加，在开花后25 d 皂苷含量达到最高后逐渐减少。均与本实验所研究趋势相近，其皂苷所存在位置对皂苷含量影响较大，随生长时间的延长出现先升高后下降的趋势。因此可以确定豆角皂苷主要存在部位为豆角种子中，且在不同生长期含量差别较大。因为随着豆角生长周期的延长，经过甲酸戊醛代谢途径等一系列反应最终形成三萜皂苷类化合物，使皂苷含量升高，达到峰值后，由于温度升高，豆角内部水分大量流失，皂苷等活性物质损失，导致其含量下降。

2.2 发芽处理对豆角种子皂苷含量的影响

本文选取在海南种植的满堂彩豆角及东北特色品种的金冠豆角做发芽处理，由于前期测定结果得到满堂彩及金冠两个品种豆角中总皂苷含量较高于其他品种，而满堂彩豆角属于海南品种，金冠豆角是东北地区特色油豆角品种，前期课题组已对金冠豆角种子中α-淀粉酶抑制剂进行研究，为进一步探究地域差异对豆角皂苷含量的影响，因此选择满堂彩和金冠豆角进行发芽处理。

由图2 可知，对于不同氯化钠浓度处理和空白组来说，在金冠种子发芽后1～4 d，其皂苷含量相比于发芽前（12.04±0.62）mg/g 均显著下降（P<0.05）。Huang 等[15]研究发现发芽处理3 d 后，黑皮大豆中总皂苷含量较发芽前略有降低，与本实验结果相似。本实验四组氯化钠浓度处理下均在发芽后1 d 皂苷含量最高，2～3 d 含量降低，第4 d 含量升高，可以得出皂苷含量与萌芽时间密切相关。可能是由于氯化钠浓度的改变可以在一定程度上影响植物皂苷的合成途径，抑制了皂苷合成所需的物质代谢和关键酶活性（图3）[16-17]。

图2 氯化钠溶液发芽处理对金冠种子皂苷含量的影响Fig.2 Effects of sprouting treatment with sodium chloride solution on the content of saponins in Golden Crown seeds

图3 三萜皂苷类化合物合成途径Fig.3 Synthetic pathway of triterpenoid saponins

高春霞等[18]也发现发芽4 d 后大豆中皂苷含量从2.8%增加到8.9%，与本实验结果相似。如表2所示，本实验四种浓度处理后，皂苷含量均在发芽第2 d 下降，3 d 含量升高，4 d 含量下降，且均在3 d 时皂苷含量最高。通过发芽处理可以显著提高满堂彩种子皂苷含量，且皂苷含量与萌芽时间和豆角品种密切相关。Alam 等[19]和Sarkar 等[20-20]采用氯化钠等前处理方法对种子进行诱导，发现其活性物质含量增加，而本实验随氯化钠浓度升高，呈先上升后下降的趋势，可能是随着氯化钠浓度改变，通过调节皂苷合成酶来适应浓度改变，说明适度的盐胁迫有利于种子生长以及豆角总皂苷的积累[21-22]。

表2 氯化钠发芽处理对满堂彩种子皂苷含量的影响（mg/g）Table 2 Effect of sodium chloride germination treatment on saponin content of Mantangcai seeds (mg/g)

2.3 UHPLC-Q-TOF-MS 对金冠种子粗皂苷的化学成分分析

由于课题组前期对金冠豆角种子中α-淀粉酶抑制剂进行研究，为进一步挖掘金冠豆角种子的价值，因此对金冠种子粗皂苷进行液质联用分析。

如图4 为金冠粗皂苷在UHPLC-Q-TOF-MS 得到的质荷比与相对丰度的相关性图。经过液质联用对金冠种子粗皂苷进行鉴定，通过查出阅文献建立谱库共分析出柴胡皂苷F、赤豆皂苷II、黄芪皂苷IV等7 种皂苷，如表3 所示。

图4 金冠种子粗皂苷在UHPLC-Q-TOF-MS 质谱图Fig.4 Mass spectrum of crude saponin from golden crown seeds in UHPLC-Q-TOF-MS

表3 金冠种子粗皂苷成分分析Table 3 Composition analysis of crude saponins in golden crown seeds

其中，柴胡皂苷F 具有抗病毒作用[26]，赤豆皂苷II 具有利水消肿，解毒排脓等功效；黄芪皂苷IV 是中医临床上常用的中药材，在食品、保健品、化妆品等行业具有广泛的应用前景[27]。竹节参皂苷V 甲酯在抗炎，抗心肌缺血，保护肝损害和延缓衰老等方面具有重要的作用[28]。大豆皂苷元D 具有多种生物学活性，包括抗肿瘤，抗癌，预防肥胖和免疫调节等[29-30]。远志皂苷元具有降低神经细胞炎症反应的作用[31]，可为缓解抗肿瘤药物的毒副作用寻找新的突破口。

3 结论

豆角种子及荚皮中均含有皂苷类成分，且豆角种子中皂苷含量高于荚皮含量，随着生长周期的增加豆角中总皂苷含量呈现先升高后下降的趋势，且通过发芽处理可以显著改变皂苷含量（P<0.05），且含量变化与萌芽时间、豆角品种密切相关。发芽时协同盐胁迫处理可以显著提高豆角种子中皂苷含量。通过液质联用方法共鉴定出7 种皂苷类物质，在食品、保健品、医疗等领域具有广泛应用前景。目前本实验仅做了提取含量分析及活性成分鉴定，缺少应用、结构鉴定及功能评价，需要在未来进行进一步研究。