食品中硒形态的HPLC-ICP/MS测定方法

胡银川，谭欣，钟洋，唐静

四川省食品检验研究院（成都 610097）

硒是人体重要的微量元素，人体中的硒通常以硒蛋白的形式发挥生物学功能，它们在免疫调节、抗氧化、清除自由基、防癌抗癌、延缓机体衰老、拮抗重金属等方面发挥重要作用[1]。1973年世界卫生组织将硒定为人和动物必需的微量元素。1988年中国营养家学会将硒列入每日必须摄入的15种膳食营养元素[2]。2017版《中国居民膳食营养素参考摄入量》规定成人对硒的平均需求量为50 μg/d，推荐摄入量为60 μg/d，可耐受最高摄入量为400 μg/d。我国成人从膳食中硒平均摄入量仅为36.7 μg/d，低于平均需要量50 μg/d[3]。调查显示，我国约72%以上地区、7亿人处于贫硒和低硒区[4]。硒由无机硒和有机硒两大类组成。无机硒主要以硒酸盐和亚硒酸盐存在；有机硒主要以硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸和硒肽等形式存在[5]。无机硒不易被人体吸收，生物有效性低，具有较大的毒性，不适宜人类食用，因而被严格限制使用，而来源于生物体内的有机硒毒性小，生物利用率高，则成为人类从食物中获得硒的重要来源[6]。准确测定食品中硒存在形态及其含量，对富硒食品开发和人体按需补硒具有重要意义[7]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Nexiontm 350X电感耦合等离子体质谱仪、Altus高效液相色谱仪、Aqueous C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美国PerkinElmer公司；MARS-X微波萃取仪（美国CEM公司）；Multifuge低温高速离心机、Genpure纯水仪（美国Thermo公司）；IDH30超声波清洗机（德国IRM公司）。

硒酸根[Se(VI)]标准溶液、亚硒酸根[Se(IV)]标准溶液、硒代胱氨酸（SeCys2）标准溶液、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）标准溶液、硒代蛋氨酸（SeMet）标准溶液（中国计量科学研究院）；硒代乙硫氨酸（SeEt，加拿大TRC公司）；氨水，盐酸、硼氢化钾、氢氧化钾、磷酸二氢钾、氯化钾、碘化钾（均为优级纯，成都市科隆化学品有限公司）；链霉蛋白酶E（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，Sigma公司）。

1.2 样品前处理

将样品粉碎均匀，称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品于微波消解管中，加入25 mL水，加入50 mg链霉蛋白酶E，于37 ℃微波萃取30 min。移取萃取溶液于50 mL离心管中，以8 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm水相滤膜过滤，HPLC-ICP/MS分析。

1.3 色谱条件

流动相为40 mmoL/L柠檬酸+1.5 mmoL/L己烷磺酸钠+2%甲醇；等度洗脱；柱温25 ℃；流速1.0 mL/min，进样量50 μL。

1.4 质谱条件

射频功率1 150 W；雾化器流速0.83 L/min；等离子体气体流速18 L/min；辅助气流速1.2 L/min；氦气流速5 mL/min；分析模式为KED模式，质荷比（m/z）78。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法选择

形态分析前处理方法主要有酶解法、酸解法和缓冲盐提取法，酸解法与缓冲盐提取法能够有效提取出无机硒，但对有机硒的提取效果较差，并且酸解法采用强酸提取，酸的还原性容易导致硒形态转变。因此，采取微波辅助酶解法进行提取。

2.1.1 链霉蛋白酶E使用量选择

考察不同链霉蛋白酶E使用量对硒提取率的影响。在其他条件不变情况下，链霉蛋白酶E使用量分别为30，40，50，60和70 mg，试验结果见图1。链霉蛋白酶E使用量大于50 mg时，硒提取率未见明显提高，故选择链霉蛋白酶E使用量50 mg。

图1 链霉蛋白酶E使用量对硒提取率影响

2.1.2 微波萃取温度选择

考察不同微波萃取温度对硒提取率的影响。在其他前处理条件不变情况下，微波萃取温度分别为25，30，35，37，40和45 ℃时，试验结果见图2。微波萃取温度37 ℃时，硒提取率最高，故选择微波萃取温度37 ℃。

图2 微波萃取温度对硒提取率影响

2.1.3 微波萃取时间选择

考察不同微波萃取时间对硒提取率的影响。在其他前处理条件不变情况下，微波萃取时间分别为10，20，30，40和50 min，试验结果见图3。微波萃取时间大于30 min时，硒形态提取率不再显著增加，故选择微波萃取时间30 min。

图3 微波萃取时间对提取率影响

2.2 色谱柱选择

形态分析主要采用阴离子色谱柱和C18反相色谱柱。对Hamilton公司的PRP-X100（250 mm×4.1 mm×10 μm）阴离子色谱柱和Perkin Elmer公司的Aqueous C18（150 mm×4.6 mm×5 μm）反相色谱柱对硒形态分离效果进行比较，试验结果见图4和图5。与PRP-X100阴离子色谱柱相比，Aqueous C18反相色谱柱分析时间短，分离度较好，峰形尖锐，灵敏度高，故选择Aqueous C18反相色谱柱对硒形态进行分析。

图4 PRP-X100阴离子色谱柱色谱图

图5 Aqueous C18反向色谱柱色谱图

2.3 流动相柠檬酸浓度选择

在其他分析条件不变情况下，考察浓度分别为10，20，30，40和50 mmoL/L的柠檬酸对各硒形态分离度和灵敏度影响，试验结果见图6。随着柠檬酸浓度增加，各硒形态分离度变大。柠檬酸浓度40 mmoL/L时，各硒形态响应值之和最大。故选择柠檬酸浓度40 mmoL/L。

图6 柠檬酸浓度对硒形态分离度影响

2.4 流动相pH选择

在其他分析条件不变情况下，考察pH分别为2.4，3.0，3.6和4.0时，对各硒形态分离度影响，试验结果见图7。pH与保留时间成反比，pH越大，各目标物保留时间缩短。pH 2.4时，分析时间较长，硒代乙硫氨酸峰宽较宽，峰型较差；pH 3.6和4.0时，硒酸根和亚硒酸根未能完全分离，分离度较差。故选择流动相pH 3.0。

图7 pH对硒形态分离度影响

2.5 流动相流速选择

在其他分析条件不变情况下，考察流动相流速分别为0.8，1.0，1.2和1.4 mL/min对各硒形态分离度影响，试验结果见图8。随着流动相流速的增加，各硒形态的保留时间缩短。流速1.2和1.4 mL/min时硒酸根和亚硒酸根未能完全分离，分离度较差；流速0.8 mL/min时，硒代乙硫氨酸峰宽较宽，峰型较差；流速1.0 mL/min时，各硒形态可实现完全分离，分离度较好。故选择流动相流速1.0 mL/min。

图8 流动相流速对硒形态分离度影响

2.6 柱温选择

考察柱温对各硒形态分离度影响。在其他分析条件不变情况下，柱温分别为20，25，30，35和40 ℃。根据试验结果，柱温变化对硒形态分离度影响较小。故柱温选择常温25 ℃。

2.7 流动相中甲醇体积分数选择

在其他分析条件不变情况下，考察甲醇体积分数分别为1.0%，1.5%，2.0%和2.5%对硒形态分离度影响，试验结果见图9。甲醇体积分数为1.0%和1.5%时，分析时间较长，硒代乙硫氨酸峰宽较宽，峰型较差；甲醇体积分数为2.5%时，硒酸根和亚硒酸根未能完全分离；甲醇体积分数为2.0%时，各硒形态可实现完全分离，且峰型较好。故选择甲醇体积分数2.0%。

图9 甲醇浓度对硒形态分离度影响

2.8 校正曲线

取硒酸根、亚硒酸根、甲基-硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代乙硫氨酸混合标准系列溶液（1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/L），按照上述色谱条件进行分析，外标法定量，以峰面积y对质量浓度x（μg/L）进行线性回归，硒形态校正曲线回归方程和相关系数见表1。由5种硒形态在1～50 μg/L的范围内线性关性良好，相关系数（R2）均大于0.999。

表1 硒形态校正曲线

2.9 方法检出限和定量限

按照逐级稀释法求方法检出限和定量限。通过在空白样品中添加不同浓度硒形态标准溶液，根据目标物检出限信噪比（rSN）应不小于3，目标物定量限信噪比（rSN）应不小于10，求取各硒形态的检出限和定量限，结果见表2。

表2 硒形态的定量限和检出限 单位：mg/kg

2.10 回收率试验

为验证方法的准确度，对样品进行低、中、高3个不同水平的标准品添加回收试验，每个添加水平分别进行6次平行试验，计算平均回收率和相对标准偏差。称取混合均匀的样品按照添加水平为0，0.5，1.0和2.5 mg/kg这4个浓度水平进行加标回收试验，按照样品前处理方法进行处理，外标法定量，试验结果见表3。硒形态的低浓度加标回收率在85.01%～95.20%之间；中浓度加标回收率在85.81%～98.86%之间；高浓度加标回收率在89.33%～99.01%之间，相对标准偏差（SRSD）均小于5%，表明试验方法具有较高的准确度。

表3 加标回收试验（n=6）

2.11 精密度试验

根据方法检出限和线性范围，对1.0和2.5 mg/kg这2个加标浓度样品进行精密度试验，每个加标浓度进行12次平行试验，试验结果见表4。加标质量分数1.0和2.5 mg/kg时，5种硒形态的相对标准偏差均在5%内，表明试验方法的精密度良好；加标质量分数2.5 mg/kg比1.0 mg/kg的相对标准偏差小，表明在线性范围内，高浓度相对于低浓度的精密度更好。

表4 方法精密度（n=12）

2.12 常见食品中硒的存在形态及其含量

通过建立的方法对市售22种常见食品中硒形态进行测定。食用菌、水产品、鸡蛋和畜禽肉及其内脏均含有有机硒；畜禽内脏有机硒含量高于肉体；牛肝菌中有机硒含量较高；富硒茶叶、富硒大米和小麦粉含有少量有机硒；纯净水、牛奶、蔬菜、水果、食用油、白醋、酱油未检出有机硒。

3 结论

建立高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定食品中5种硒形态分析方法。称取0.5 g样品于微波消解管中，加入25 mL水，加入50 mg链霉蛋白酶E，于37 ℃微波萃取30 min。移取萃取溶液于50 mL离心管中，以8 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm水相滤膜过滤，HPLC-ICP/MS分析。5种硒形态在1～50 μg/L范围内呈现良好线性关系（R2＞0.999），方法检出限小于0.1 mg/kg；在0.5，1.0和2.5 mg/kg这3个样品加标水平，回收率在85.01%～99.90%之间；方法精密度试验相对准偏差在5%之内。该试验为食品硒形态评价和质量控制提供依据。