MIP-SPE-HPLC法测定功能性油脂中15种多环芳烃

邓龙，周思 ，罗晓燕，黄佳佳

1.广东食品药品职业学院（广州 510520）；2.广州市疾病预防控制中心（广州 510440）

多环芳烃（PAHs）是一类具有重大健康危害的持久性有机污染物[1-3]。油脂是人体摄入PAHs的主要来源之一[4-5]。国内外对油脂中的PAHs均有严格限量规定[6-7]。功能性油脂作为一类具有调节机体、预防疾病等保健功能的特殊油脂类物质，产品受众多为婴幼儿、孕妇、老年人等敏感人群，相关产品中PAHs含量水平检测暂未见专门报道[6,8]。建立稳定可靠的功能性油脂中PAHs筛查方法、掌握市售功能性油脂产品中PAHs污染现状并提示风险，可为人群健康及相关限量标准的研究提供参考。15种目标PAHs理化性质参数见表1。

PAHs检测仪器方法成熟，以气相色谱-串联质谱法和高效液相色谱荧光检测器法为主，后者灵敏度相对更高[9-14]。功能性油脂中PAHs含量水平低和基质干扰严重是检测面临的主要挑战，如何进行样品前处理十分重要。多采用皂化、液液萃取、超声萃取等提取，凝胶色谱、固相萃取等净化[14]，操作繁琐，稳定性和重复性欠佳[15-16]。分子印迹固相萃取（MIPSPE）基于选定的模板分子结构进行识别，实现目标物的高效提取与富集，操作简单，已应用于不同样品中PAHs的处理[17-20]。受浓缩过程易损失、印迹模板吸附不牢等因素影响，轻质多环芳烃稳定性与回收率欠佳，仍待进一步研究[9,17,19-20]。

试验结合分子印迹固相萃取技术与高效液相色谱荧光检测器法，逐一优化淋洗、洗脱、浓缩等条件，旨在建立一种稳定可靠的功能性油脂中PAHs检测方法，并对市售功能性油脂产品中PAHs污染水平进行筛查与风险分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

功能性油脂27款（购于当地商店或电商平台），包括鱼油（4款）、鱼肝油（3款）、米糠油（2款）、葡萄籽油（2款）、紫苏油（1款）、月见草油（2款）、胚芽油（4款）、沙棘子油（1款）、红花籽油（2款）、鳄梨油（1款）、藻油（3款）、海藻油（2款）。15种多环芳烃标准品（质量浓度2 000 μg/mL，北京坛墨公司）；乙腈、正己烷、二氯甲烷等试剂（色谱纯，德国Merck公司）；多环芳烃分子印迹固相萃取柱（500 mg/6 mL，上海安谱科技股份有限公司）；PAH C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司）。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY Arc超高效液相色谱仪配荧光检测器（美国Waters公司）；VORTEX MS3漩涡混合器（德国IKA公司）；FV64全自动智能氮吹仪（广州得泰公司）；固相萃取装置（美国Waters公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

目标物用乙腈配制成质量浓度100 mg/L的标准储备液，于-20 ℃冰箱避光保存。吸取适量标准储备液，用乙腈稀释成质量浓度5.00 mg/L的混合标准溶液，于-20 ℃冰箱避光保存。使用时，用乙腈逐级稀释成质量浓度0.2，0.5，1.0，5.0，10和50 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品的提取与净化

液体样本混匀后直接取样，胶囊样本去壳混匀后取样，准确称取0.5 g（精确至0.01 g）样本于10 mL具塞离心管中，加入3 mL正己烷，漩涡混匀。MIP-SPE柱用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化，将样品溶液全部转移至小柱，待自然流出，取6 mL正己烷淋洗，用8 mL二氯甲烷洗脱。洗脱液于带刻度细底氮吹管25 ℃氮吹至100 μL，加入0.5 mL乙腈复溶，转移至非针式过滤瓶，待上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱PAH C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量10 μL：柱温30 ℃；流动相为乙腈-水溶液，流速1.2 mL/min，梯度洗脱程序：初始乙腈60%，15 min升至100%，保持10 min，1 min乙腈降至60%，保持9 min，总时长35 min。荧光检测器激发-发射波长设置见表2。

2 结果与分析

2.1 淋洗溶剂的优化

功能性油脂含有的大量甘油三酯及脂肪伴随物是产生基质干扰的主要原因[6]。使用分子印迹材料吸附目标物后，用正己烷淋洗掉样本基质是减少干扰的关键[13]。15种目标PAHs根据苯环数可以分为轻质多环芳烃（LPAHs）、中质多环芳烃（MPAHs）和重质多环芳烃（HPAHs）。由于以LPAHs为模板形成的印迹空腔太小，无法选择性富集样品中的中质、HPAHs[21]。商业化分子印迹材料多以4环及4环以上多环芳烃为模板，合成的分子印迹材料对LPAHs的特异性吸附不强，淋洗时容易从印迹空腔中洗脱，导致回收率偏低[17]。需细致优化淋洗溶剂用量，保证回收率同时最大程度减少样本基质干扰。取0.1 mL质量浓度50 μg/L的PAHs混标溶液加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液氮吹至0.5 mL后上机测试，得到PAHs洗脱曲线，见图1（A）。分别取0.5 g鱼油、胚芽油、藻油样品，用3 mL正己烷稀释混匀加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液吹干后称重，扣除氮吹管质量为洗脱样品质量，得到样品洗脱曲线，见图1（B）。结合图1（A和B）可以看出，淋洗溶剂体积6 mL时可去除90%以上的样本基质且LPAHs损失在5%以内，MPAHs和HPAHs吸附稳定，6 mL正己烷淋洗损失不到1%，故淋洗溶液体积选择6 mL。

图1 淋洗溶剂对回收率及净化效果的影响

2.2 洗脱溶剂的优化

PAHs辛醇-水分配系数较高，难溶于水，易溶于有机溶剂，常用萃取溶剂有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等[17-22]。正己烷洗脱力强，同时易将固相萃取小柱上残存的脂肪伴随物洗脱下来，使得非目标化合物干扰增多。乙腈对样品基质的洗脱具有一定选择性，但浓缩耗时，易导致LPAHs损失。试验比较二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮3种溶剂的洗脱效果，详见图2（A）。二氯甲烷作为洗脱溶剂效果最佳，15种PAHs的回收率均大于70.0%。进一步优化洗脱溶剂用量，洗脱溶剂用量对回收率的影响见图2（B）。溶剂用量4 mL时，洗脱不充分，大部分HPAHs回收率偏低。溶剂用量增至8 mL时，15种PAHs的回收率均超过75.0%。进一步增加溶剂用量，MPAHs和HPAHs回收率略有增加，LPAHs回收率降低。这是因为洗脱溶剂体积增加延长氮吹浓缩时间，导致LPAHs损失。因此，选择8 mL二氯甲烷进行洗脱。

2.3 氮吹条件的优化

氮吹浓缩是前处理过程的最后环节，对苯环数少、分子量小的LPAHs影响尤为明显[23]。由表1可知，LPAHs蒸汽压大、沸点低，在浓缩过程中易挥发，导致回收率偏低。文献报道的单因素试验研究显示影响回收率的主要因素有氮气压力[24]、水浴温度[25]、浓缩体积[9]等，综合最佳浓缩条件有待进一步探究。试验用二氯甲烷配制质量浓度1.0 μg/L的混合标准溶液，以15种PAHs的平均回收率为指标，氮气压力、水浴温度、浓缩体积为变量，开展三因素四水平正交试验，因素水平表见表3，试验设计及结果见表4。根据方差R分析可得，对回收率的影响依次为浓缩体积＞氮气压力＞水浴温度。通过比较K值得到试验最佳因素组合A2B1C3，按照正交试验所得最优条件进行3次验证试验，测得平均回收率为87.4%，略低于试验5的回收率87.8%，确定该正交试验的最优选择为A2B1C2，即25 ℃水浴加热，8 psi氮气压力氮吹，浓缩至100 μL。

表3 正交试验因素水平表

表4 正交试验设计及结果

2.4 色谱条件的优化

15种PAHs包含同分异构体和结构相似物，需优化色谱条件实现目标物的色谱分离。使用常规C18色谱柱进行分析，ACP、FLU等化合物保留时间接近，分离效果不佳。可通过调节梯度洗脱条件实现目标物基线分离，但分析时间过长，不利于检测工作的开展。试验选择Waters PAH C18色谱柱对15种PAHs进行分析，PAH C18柱根据PAHs的结构特点对固定相进行修饰，进而改善峰型，提高目标物分离度，在22 min内实现所有目标物基线分离，ACP与FLU分离度大于1.5，目标物峰型尖锐，对称性好，检测分离度和灵敏度得到大幅提高。15种PAHs色谱图如图3所示。此外，荧光检测中激发波长和发射波长的选择也会影响检测灵敏度[22]。试验采用2D单通道模式优化激发和发射波长，得到最佳信号响应，优化后的激发-发射波长见表2。

图3 色谱图

2.5 线性范围与检出限

在优化条件下，测试1.3.1节配制的混合标准工作溶液。以目标物峰面积（y）对质量浓度（x，μg/L）进行线性拟合。结果表明。15种PAHs在0.2～50 μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。选择低添加水平样品，以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，结合样品前处理过程，得到方法检出限0.03～0.20 μg/kg、方法定量限0.1～0.6 μg/kg，详见表5。

表5 化合物的线性方程、相关系数、线性范围、方法检出限和方法定量限

2.6 回收率与精密度

采用试验方法对鱼油样本进行低、中、高三水平加标回收试验，每个水平重复测定6次，结果见表6。结果表明，在加标浓度范围内，15种待测物平均回收率为72.3%～98.5%，相对标准偏差（SRSD，n=6）为2.1%～6.1%，方法回收率与精密度良好。

表6 加标回收和精密度实测定结果（n=6）

2.7 实际样品的测定

利用建立的方法对27份市售功能性油脂样品进行检测，分析结果见表7。27份样本均有不同程度的PAHs检出，检出种类包含15种PAHs，检出率为7.4%～100.0%，检出水平均值为0.61～7.15 μg/kg。从检出物质来看，检出水平最高的是萘，其次是菲和芘，检出水平最低的是二苯并[a,h]蒽。参考GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》限量标准，检出苯并[a]芘大于10 μg/kg的样本1份。参考欧盟（EC）No 835/2011条例规定，检出苯并[a]芘大于2 μg/kg的样品4份，PAH4（苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘4种PAHs）总量超过10 μg/kg的样本2份，提示功能性油脂存在一定PAHs污染风险。

表7 实际样本测定结果

3 结论

建立功能性油脂中15种PAHs的分子印迹固相萃取-高效液相色谱荧光检测方法。通过优化淋洗、洗脱、浓缩条件，有效提高了LPAHs回收率。15种PAHs回收率在72.3%～98.5%之间，相对标准偏差小于6.1%。相比于国标方法，前处理操作简单，有机试剂消耗量少，方法检出限低。各项指标均能满足日常检测分析要求，适用于功能性油脂中PAHs的测定。采用试验方法对27份市售样本进行筛查，提示我国功能性油脂产品受到不同程度PAHs污染，15种目标PAHs检出率为100.0%，检出水平为0.61～7.15 μg/kg，部分产品苯并[a]芘、PAH4值超出参考限值标准，需进一步监测以全面评估其健康风险。