同位素内标-液相色谱-串联质谱测定牛奶中加米霉素

陈心怡，李丽苏，刘佳娜，赵凤娟,，吴凤琪,

1.深圳海关食品检验检疫技术中心（深圳 518045）；2.深圳市食品安全检测技术研发重点实验室（深圳 518045）

牛呼吸系统疾病（bovine respiratory disease，BRD）是多发于小牛上的常见疾病，每年对全球牛饲养业造成数十亿美元损失[1]。BRD发病机制涉及多种因素，而多杀巴斯德菌、嗜睡嗜血杆菌等致病菌感染是一个重要诱因。加米霉素（Gamithromycin）是一种主要用于治疗BRD的药物[2]，结构式如图1所示，分子式为C40H76N2O12。加米霉素属于第二代大环内酯类兽用抗生素[17]，吸收快、渗透率高、治疗效果好[3]。加米霉素通过竞争性结合细菌核糖体50S亚基，阻碍细菌蛋白质合成从而达到抑菌效果[4]。自2008年起，欧盟和美国FDA批准加米霉素用于预防和治疗非泌乳牛的呼吸系统疾病，并取得较好效果[13]。欧盟（EU No 470/2009）规定加米霉素在泌乳期禁用。

图1 加米霉素的分子结构式

加米霉素残留量测定方法主要有HPLC[5-9]和HPLCMS/MS[10-14]。加米霉素的紫外吸收弱且最大吸收波长（215 nm）与流动相中甲醇（190 nm）和乙腈（205 nm）接近[13]，使得高效液相色谱法测定加米霉素的灵敏度低。而液相色谱串联质谱法对测定加米霉素的结果重现性好且灵敏度更高，被广泛应用于加米霉素残留量的测定。样品的前处理和净化过程会直接影响液相色谱串联质谱法的灵敏度和精密度。对于加米霉素的测定，前处理过程大多会采用固相萃取柱（SPE）净化，但固相萃取柱成本高、耗时长、步骤繁琐，容易造成损失而影响定量的准确性，因此试验采用乙腈直接提取的前处理过程以节省试验时长。另外，在国内外关于加米霉素残留量测定的报道中，大部分是对食用组织比如动物可食性组织[13-15]或水产品[12]的残留检测，例如王艳艳等[13]和郭洋洋等[14]的试验中是分别针对牛组织和猪组织中残留量的分析，而牛奶中加米霉素残留量测定鲜见报道，通过同位素标记法，使用液相色谱串联质谱仪，建立牛奶中加米霉素残留量的定量方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶样品来自于深圳市超市。混匀所有样品，于4 ℃保存。

加米霉素标准品（Gamithromycin，C40H76N2O12，CAS 145435-72-9，纯度95%）；加米霉素同位素内标（Gamithromycin-d4，纯度95%）；乙腈、甲醇（均为色谱纯，CNW）；0.1%甲酸-乙腈水溶液（9︰1，V/V）。

1.2 仪器与设备

5500 AB液相色谱串联质谱仪（SCIEX）；3-18KS高速冷冻离心机（Sigma）；EOAA-HM-01涡旋混合器（Anpel）；AB265-S天平（Mettler Toledo）；TurboVap LV氮吹浓缩仪（Biotage）；Elix+Milli-Q超纯水仪（Millipore）。

1.3 标准溶液配制

加米霉素标准工作液（25 μg/L）：精密称取适量加米霉素标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成质量浓度125 mg/L的加米霉素标准储备液，置于棕色玻璃瓶中，在-18 ℃以下的冰箱避光存放；精密吸取适量加米霉素标准储备液，用甲醇稀释成25 μg/L的标准工作液，于-18 ℃保存。

加米霉素内标标准工作溶液（100 μg/L）：精密称取适量同位素内标标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成质量浓度100 mg/L的加米霉素内标标准储备液，置于棕色玻璃瓶中，在-18 ℃以下的冰箱避光存放；精密吸取适量加米霉素内标标准储备液，用甲醇稀释成100 μg/L的标准工作液，于-18 ℃保存。

用上述质量浓度25 μg/L的加米霉素标准工作液和100 μg/L加米霉素内标标准工作溶液用流动相稀释成系列质量浓度为0.25，0.50，1.00，2.50和5.00 μg/L的基质混合标准工作溶液，其中内标质量浓度均为1.0 μg/L。

1.4 样品前处理方法

称取5 g（精确至0.001 g）样品于50 mL具螺旋盖带刻度聚丙烯离心管中，加入8 mL乙腈，涡旋混匀1 min后振荡20 min；以9 500 r/min离心5 min；取5 mL乙腈重复提取1次，合并提取液，定容至20 mL。取4 mL上清液至15 mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，用氮气浓缩仪于40 ℃吹至近干，用0.1%甲酸-乙腈水溶液定容至2 mL，过0.22 μm nylon66微孔滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.5 仪器分析条件

1.5.1 液相色谱分析条件

色谱柱Poroshell EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.70 mm）；柱温40 ℃；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速0.25 mL/min；进样量8.00 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序参数

1.5.2 液相色谱分析条件

离子化模式为电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式为多反应监测（MRM）；离子化温度550 ℃；CUR 20.00 psi；GS1 40.00 psi；GS2 40.00 psi；IS 5 500.0 V；CAD，Medium定量离子对等其他质谱参数见表2。

表2 加米霉素的主要质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

加米霉素分子结构易接受H+而带正电荷，因此采用正离子模式检测。以针泵注射方式将加米霉素标准溶液（0.5 mg/L）注入离子源，在ESI+模式下进行一级质谱扫描，得到m/z777.6 [M+H]+准分子离子。以m/z777.6 [M+H]+为母离子进行碰撞诱导解离，对其进行二级质谱扫描，在较低碰撞能量时（＜20 eV）无法得到有效的碎片离子，而在碰撞能量较高（＞35 eV）时，加米霉素能够产生多个明显丰度较高的碎片离子，其中主要6个碎片离子分别为m/z619.3，158.2，601.3，116.1，462.2和444.2。通过加米霉素键位断裂及碎片分子量比较分析，推断发生碎裂的位置为2个醚键处（图2），m/z619.3碎片离子是在a处发生断裂而得到，而m/z158.2碎片离子是在b处发生断裂而得到，同时m/z158.2碎片离子的烯醇结构不稳定自发地转化为羰基，在此结构的基础上，脱掉一个乙醛得到m/z116.2。当a、b处同时断裂时能得到m/z462.2。m/z619.3和m/z462.2这2个碎片离子中，羟基均会经过脱水反应形成双键，因此分别得到m/z601.3和m/z444.2这2个碎片离子。

图2 加米霉素的质谱碎裂途径

试验进一步考察不同碰撞能量对3个主要碎片离子丰度（m/z619.3，158.2和601.3）的影响，考察的碰撞能量范围为15～65 eV，结果如图3所示。碰撞能量在15 eV以下，仅有碎片离子m/z619.3有较弱信号，其他2个碎片离子无法获取信号；超过15 eV后，m/z619.3碎片离子信号强度逐步上升，在45 eV左右达到最大，而后随碰撞能量的增大而逐步降低；对于m/z158.2和m/z601.3碎片离子，碰撞能量在25 eV以上才开始出现，且在25～55 eV范围内呈逐步上升趋势，在55 eV时达到最强，超过55 eV后信号强度又有所下降。结果表明加米霉素分子结构较为稳定，因此需要较高碰撞能量才能碎裂。由于m/z619.3碎片离子信号强度较高，稳定性较好，试验选用m/z619.3作为定量离子。

图3 碰撞能量对3个主要碎片离子相应强度的影响

2.2 色谱条件的选择

试验方法通过优化流动相配比优化加米霉素及其同位素内标的响应和峰形，同时优化流动相洗脱程序使该方法能在10 min内完成以达到快速分析样品的目的。在Agilent Poroshell EC-C18色谱柱的基础上考察流动相对加米霉素出峰的影响，结果表明作为有机相，乙腈比甲醇有更好的峰形和更高的灵敏度。另外，水相中添加适量的酸会相应增强离子的响应并且优化峰型，如图4所示，纯水中添加甲酸使得加米霉素及其同位素内标响应均有显著增强，其中，不同酸度也能导致不同响应，试验考察乙腈中添加不同体积分数的甲酸水（0.1%，0.2%，0.5%和1.0%）对加米霉素及其同位素内标离子对的影响，结果表明0.1%甲酸比其他酸度更能显著增强加米霉素及其同位素内标的离子响应程度，因此选择0.1%甲酸水作为水相，乙腈作为有机相。

图4 不同水相流动相对质谱信号强度的影响

2.3 提取条件的优化

常用的加米霉素提取溶剂包括甲醇[11]、乙腈[10,14]、甲酸乙腈及0.1 mol/L磷酸盐缓冲液[13]，试验比较乙腈（含0.1%甲酸和不含0.1%甲酸）及0.1 mol/L磷酸盐缓冲液的提取效果，3种提取液对加米霉素的提取效率均达70%以上，其中采用乙腈（不含0.1%甲酸）作为提取液时，加米霉素及同位素内标的提取回收率可达91.2%～102.5%，而含0.1%甲酸的乙腈在牛奶中的提取回收率则在82.4%～101.3%，略低于乙腈。除此之外，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液则最低（71.9%～88.6%），这与Yan等[10]的试验结果相同。因此，由于乙腈的低干扰性、较高回收率和灵敏度并且能提高前处理效率，试验选择乙腈作为提取溶剂。

2.4 过滤方法的优化

试验在氮吹后用含0.1%甲酸水-乙腈（9︰1，V/V）溶剂复溶，避免测定时的溶剂效应影响加米霉素在色谱上的保留和峰形。

考虑到不同滤膜对化合物的过膜损失有显著差异，试验比较2种不同微孔滤膜对加米霉素的吸附能力的影响，分别是常用的Nylon 66微孔滤膜及PTFE微孔滤膜，2种均为0.22 μm孔径的水系滤膜。通过试验发现，使用Nylon 66的微孔滤膜平均回收率为96.7%，而使用PTFE微孔滤膜时平均回收率只有58.4%。由此可知，2种微孔滤膜都有一定吸附作用，但Nylon 66的吸附作用明显小于PTFE的吸附效果。因此，试验选择Nylon 66微孔滤膜（0.22 μm）作为滤膜。

2.5 线性范围、检出限与定量限

试验对比流动相配制的溶剂曲线和空白牛奶基质液配制的基质曲线，以其定量离子的响应丰度作为y，以定量离子的质量浓度作为x（μg/L），绘制标准工作曲线，在质量浓度范围0.25～5.00 μg/L内呈现良好的线性关系（图5），其中溶剂线性回归方程是y=62 405x-1 951，相关系数R2=0.999 4，表明加米霉素线性关系良好。由于牛奶中加米霉素为禁用物质，该方法的检出限（limit of detection，SLOQ）为0.5 μg/kg，能满足信噪比rSN≥10的要求。

图5 加米霉素的线性回归方程和相关系数

2.6 基质效应

由图6可知，加米霉素在牛奶中的基质效应（matrix effect，ME）结果显示：几乎没有基质效应（|ME|为0.57%）。因此定量分析试验中采用溶剂配制标准曲线。

图6 牛奶中添加0.50 μg/kg加米霉素及其同位素内标的MRM色谱图

液相色谱串联质谱法具有特异性和选择性，其共洗脱基质成分可能会影响电离效率。在试验方法中，通过同位素标记的内标来降低基质效应的影响。同位素内标法的应用是为校准在液相色谱质谱中经过样品前处理的样品的差异性，因此选用加米霉素-d4作为同位素内标。加米霉素-d4与加米霉素具有相同的结构和物理化学特性，该内标较好补偿了样品制备过程中分析化合物的损失。

同时为进一步使牛奶中加米霉素化合物的基质效应的影响降到最低，试验适当增加稀释倍数以达到降低一定基质效应的目的。对比不同前处理导致的不同稀释倍数（0.5，1和2倍）的试验结果影响，试验结果表明在稀释0.5倍和1倍的情况下，加米霉素的回收率在65%～70%之间，而稀释2倍可达90.2%～106%，因此通过稀释较高倍数能有效达到降低一定基质效应的作用，使得回收率有所提高。

2.7 方法回收率和精密度

在牛奶中分别加入加米霉素标准溶液和加米霉素同位素内标进行加标回收率试验。加米霉素及其同位素内标的SLOQ浓度水平的空白加标样的质量色谱图见图6。采用标准添加法，在空白牛奶中分别添加SLOQ，2倍SLOQ和10倍SLOQ这3个浓度的加米霉素药物进行回收率试验，每个浓度水平进行6个平行样品试验，重复3次，求批内和批间的平均回收率和相对标准偏差，计算结果见表3。从试验结果可以看出牛奶中加米霉素药物在0.5～5.0 μg/kg添加浓度范围内的平均回收率为90.5%～107%，相对标准偏差（relative standard deviations，SRSD）分别为1.32%～4.36%。

表3 加米霉素添加回收率及相对标准偏差

2.8 实际样品检测

试验对15份市售牛奶样品进行测试，包括蒙牛、蒙牛特仑苏、伊利、伊利金典等国产品牌，以及安佳、纽麦福、好沃德、佳德选、沃美滋等国外品牌。测定结果均为未检出（≤LOD）。

3 结论与讨论

试验建立牛奶中加米霉素残留量的同位素内标-液相色谱串联质谱快速测定法。采用乙腈直接提取，经氮吹后用流动相复溶，过尼龙滤膜后用液相色谱串联质谱分析。样品前处理步骤快速、操作简易，结果的准确度、稳定性好，采用试剂配制曲线结合同位素内标法定量，能最大程度避免基质干扰，增加检测结果准确度。批间和批内平均回收率达90%以上，相对标准偏差小于10%，能满足实验室对牛奶中加米霉素残留量快速检测的要求。