胃癌组织和远癌组织β-catenin 的表达及临床意义

陈海军 孙梓程 刘 岩 由光玉 洪东宁

（南通市第六人民医院普外科，江苏 南通 226000；2.牡丹江市第一人民医院，黑龙江 牡丹江 157001）

本研究以临床肿瘤标本为研究对象，通过实时荧光定量PCR 及West-bloting 的方法对胃癌组织中Wnt 信号通路中β-catenin 蛋白的表达状况与临床病理因素之间的关系进行分析，探讨其在胃癌发生发展中的作用机制，为临床治疗提供可能的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取我院手术切除的胃癌标本32 例为研究对象，其中男19 例，女13 例，中位年龄56 岁（39～79 岁），所有患者术前均未进行新辅助化疗。胃底贲门部肿瘤4 例，胃体部肿瘤8 例，胃窦部肿瘤20 例；pTNM 分期Ⅰ期，Ⅱ期共24 例，Ⅲ期，Ⅳ期共8 例；无淋巴结转移12 例，伴有胃周淋巴结转移20 例；低度分化8 例、中等分化16 例、高分化腺癌8例。取胃癌组织和距癌肿边缘5 cm 的远癌组织后迅速-80 ℃冻存并尽早检测。

1.2 实验仪器和试剂 ECL 发光试剂盒；KAPA SYBR FAST qPCR Kit；抗人β-catenin 单克隆抗体、内参GADPH 抗体、二抗SP 免疫组化试剂盒；TRIzol试剂、逆转录试剂盒；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒；BIO-RAD CFX96 实时定量PCR 仪；垂直电泳和水平电泳。操作步骤按说明进行。

1.3 方法 （1）RNA 提取及纯度测定：将得到胃癌组织及远癌组织分别称重，切碎，在液氮中研磨，并加以TRIzol 试剂进行裂解处理。加入氯仿200 μL，剧烈振荡，放置室温下。4 ℃条件下，以12000 rpm 转速离心15 min，收集上清（约500 uL），加入异丙醇混匀。冰上孵育。再次离心后弃去上清液。加入预冷的75 乙醇1 mL。4 ℃8000 rpm 离心10 min，弃上清。重复上述步骤，RNA 沉淀在室温下干燥，提取出总RNA。DEPC 处理的水溶液将RNA 溶解，核酸定量分析仪测RNA 纯度，OD260/280 比值在2.0 左右，-80 ℃冰箱冻存备用。根据逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，所得的cDNA 置于-20 ℃保存备用。（2）实时荧光定量PCR 检测β-catenin 基因表达：设计目的基因β-catenin 和内参基因GAPDH 引物序列并委托上海生物工程有限公司合成，采用非特异性SYBR Green 荧光染料法检测。先验证引物退火温度及特异性，选取特异性高的引物作为后续研究。反应体系配制：2×SYBR Green mix10μL，上游/下游引物（10 μmoL）各0.4μL，cDNA 1μL，补双蒸水至终体积为20 μL，加盖混匀，按照预变性：95 ℃，30 s；变性：95 ℃，5 s；退火延伸：60 ℃，30 s 反应条件进行扩增并构建溶解曲线。β-catenin：上游引物：5- GGACAAACCACAGGATTACA -3，下游引物：5-TCCACCACAGTGAAAAGAAC-3，长度180bp；GAPDH：上游引物：5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，下游引物：5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3，长度258bp。（3）West-blot 法检测β-catenin 蛋白的表达：分别取0.1 g 胃癌组织和远癌组织，经蛋白提取、定量后稀释成5 ug/uL 浓度，加入上样缓冲液Loading-Buffer 混匀煮沸5 min，上样，SDS-PDGE 胶电泳，转膜，将转膜后的PVDF 膜在5%脱脂奶粉封闭，分别加目的蛋白一抗及内参一抗（1：400）4 ℃冰箱过夜孵育，次日PBST洗膜3 次，5 min/次，用5%脱脂奶粉稀释的二抗（浓度1：2000）室温孵育1 h，PBST 洗膜3 次，5 min/次，ECL 发光，暗室胶片曝光。以GAPDH 为内参，采用仪器自带软件进行定量分析并记录其相对光密度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 软件处理，计量数据以（±s）表示，用t 检验；计数资料用[n（%）]表示，用χ2检验或Fisher 确切概率法，组间比较用Kruskal-Wallis H 检验，其表达相关性用Spearman 秩相关性分析。

2 结果

2.1 RT-PCR 扩增产物的特异性 RT-PCR 采用两步法扩增，适宜退火延伸温度为60 ℃，熔解曲线示集中单峰，表明特异性较好；β-catenin 与GADPH 标准曲线斜率一致性较高，表示二者扩增效率基本一致。采用ΔΔC（t）法，以人GADPH 基因为内参，远癌组织β-catenin mRNA 相对表达量为1.000，胃癌组织中β-catenin mRNA 表达明显高于远癌组织，差异显著（P＜0.05），β-catenin 基因PCR 扩增产物电泳结果：A.胃癌组织B.远癌组织，见图1。

图1

2.2 β-catenin 蛋白的表达 West-bloting 结果显示：胃癌组织中β-catenin 蛋白表达量高于远癌组织表达量，差异显著（P＜0.05）。West-bloting 法检测胃癌组织及远癌组织β-catenin 蛋白的表达情况，见图2。

图2

2.3 远癌组织与胃癌组织β-catenin 基因与蛋白相对表达量统计 胃癌组织的β-catenin mRNA 和蛋白的表达量显著高于远癌组织表达量，差异显著（P＜0.05），见表1。

表1 远癌组织与胃癌组织β-catenin 基因

2.4 胃癌组织β-catenin 的表达与临床病理特征之间的关系 β-catenin 蛋白的阳性表达在低分化、晚期肿瘤及有淋巴结转移的胃癌组织中表达相对较高，但与年龄、性别、部位、分化程度、TNM 分期、淋巴结有无转移等临床病理特征之间无明显相关性（P＞0.05），见表2。

表2 胃癌组织β-catenin 的表达与临床病理

3 讨论

Wnt 信号通路是一条进化比较保守的信号传导途径，存在于各种动物体内，参与细胞增殖、分化和凋亡的调控，在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥重要作用，它包括Wnt/β-catenin 信号通路、Wnt/Ca2+信号通路及由c-Jun N 端激酶（JNK）介导的细胞极性信号通路等细胞内信号通路[1]。Wnt/β-catenin 信号通路是Wnt 信号通路的经典通路，由Wnt 蛋白、跨膜受体、胞质蛋白、核内转录因子等，位于胞质内的散乱蛋白（Dsh）、结肠腺瘤样息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、轴蛋白（Axin）及β-连接蛋白（βcatenin），核内转录因子如转录活化因子CBP 及T 细胞转录因子/淋巴样增强因子（TCF/LEF）等[2]。尽管Wnt 信号通路由多种蛋白构成，但β-catenin 在细胞内浓度可改变各种调节因子，使肿瘤细胞的迁移及侵袭能力加强。研究表明[3]细胞中β-catenin 的表达与肿瘤的转化和浸润密切相关。Ishigaki K[4]通过研究胃癌细胞和原发性胃癌β-catenin 基因突变和表达情况，发现基因的突变与β-catenin 蛋白在核内堆积有相关性，推测β-catenin 异常的细胞内分布与细胞恶性转化、增殖密切相关[5]。

多研究表明Wnt 信号通路激活与肿瘤转移存在一定关系[6]。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信号通路关键信号分子，我们采用实时荧光定量PCR、West-bloting 的方法，比较胃癌组织和远癌组织标本β-catenin表达的水平，观察到远癌组织内β-catenin mRNA 及蛋白都呈低表达，而胃癌组织内的β-catenin mRNA及蛋白表达较远癌组织升高（P＜0.05），提示β-catenin参与胃癌的发生与发展过程。Wnt/β-catenin 信号通路下游靶基因如原癌基因c-myc、细胞周期蛋白D1和金属蛋白酶等在肿瘤的发生和转移中扮演重要作用，而β-catenin 与下游靶基因之间构成了一个错综复杂的网络[7]。本研究中β-catenin 蛋白的阳性表达与肿瘤发生部位、分化程度、分期及有无淋巴结转移及患者性别、年龄因素无明显相关性（P＞0.05），与上述结果不一致，提示我们β-catenin 在胃癌转移过程中的作用机制目前仍不清楚，随着分子生物学技术的不断发展，相信转录因子β-catenin 的功能将不断被发现，其作用机制及信号通路将会进一步被阐明，也为胃癌的临床诊疗提供一个新的靶点。