基于HS-SPME-GC-MS对传统剁椒发酵过程中挥发性成分和关键香气物质分析

何旭峰,易良键,郑容,王圣开,周祥德,熊双,黄小兰*,冉光荣

1(重庆市万州食品药品检验所,重庆,404100)2(重庆市万州区伴神酿造有限公司,重庆,404130)

辣椒(CapsicumannuumL.)为一年生茄科草本植物,在我国四川、贵州、重庆、河南、湖南、宁夏、新疆等地均有大量种植,总面积超2 000万亩,占全球的1/3,总产量4 000万t,占世界辣椒总产量的一半以上[1]。辣椒含有丰富的营养物质,是维生素的主要来源,尤其是维生素C含量特别突出,具有开胃消食、驱寒除湿、抗氧化、降血压等作用[2-3],辣椒加工品主要有干辣椒、辣椒粉、泡椒、剁椒、辣椒酱等[4]。其中剁椒是辣椒的加工制品之一,在嗜辣群体集中、调味品市场丰富的川渝地区,剁椒凭借其独特的口感与风味及其潜在的消费市场,成为调味品市场中的后起之秀。传统剁椒以辣椒为原料,经清洗、剁碎、腌制等前处理,再按比例加入蒜末、姜末、食盐、白酒及白砂糖等辅料,搅拌混匀,入坛密封,由天然附着菌种自然发酵而成。可用于重庆小面、羊肉米粉、剁椒鱼头、万州烤鱼、凉粉等餐饮食品,也可直接拌饭食用,亦是万州烤鱼调料的重要原料,香气突出,风味独特,深受人们喜爱[5]。

剁椒风味是评价其质量优劣、影响消费者购买的重要指标[6],其形成过程受众多因素的影响,如辣椒品种[7-9]、腌制盐度[10-12]、发酵方式及菌种[4,13]等,是复杂而微妙的。同时剁椒作为微生物发酵产品,发酵环境、发酵时间也是影响风味的关键因素,罗凤莲[14]发现湖南剁椒自然发酵1～4周,其挥发性风味物质种类和含量差异显著;崔桂娟[15]进一步研究发现发酵第18天时,剁椒挥发性组分多达148种,酯类物质种类最多,烯烃类含量最高;肖何等[6]揭示了湖南不同产地农家剁辣椒的品质和风味存在明显差异性;这说明发酵环境和时间对自然发酵剁椒的风味影响较大。而川渝地区近年来受三峡库区的影响,形成了高温高湿的自然环境,自然发酵过程中传统剁椒的风味变化未见相关文献报道。

因此,本研究选取具有代表性的万州传统剁椒为研究对象,采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[16-17],对不同发酵时间自然发酵剁椒的挥发性成分进行测定分析,筛选出关键性香气物质,并进行相关性分析,旨在为万州传统剁椒的标准化生产提供依据,同时为川渝地区剁椒质量分析提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

万州传统剁椒,重庆市万州区伴神酿造有限公司;色谱纯仲辛醇,上海麦克林生化科技有限公司;其余试剂为分析纯,成都市科隆化学品有限公司;水为实验室自制纯水。

1.2 仪器与设备

7000C型气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司;PAL3自动进样平台,CTC分析仪器股份公司;50 μm膜厚的Divinylbenzenne/Carboxen/PDMS顶空固相微萃取头,美国Supelco公司;Milli-Q Advantage A10型超纯水机,密理博中国有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 传统剁椒工艺流程

将辣椒洗净、晾干,剁成2 mm×2 mm的颗粒,将二青条和小米辣以7∶3的质量比混合,再加入辅料(食盐10%,大蒜10%,姜10%,白糖2.5%,质量分数)搅拌均匀,装坛密封,发酵。

分别于密封发酵0、10、20、30、40、50和60 d后采集样品,依次编号为F0、F10、F20、F30、F40、F50、F60,样品经均质后置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 感官评价

选择8位经过培训的人员组成感官评价小组,分别对剁椒的色泽、脆度、香气、滋味4个方面按照表1的评分标准进行打分,结果取平均值。

1.3.3 挥发性成分的测定

固相萃取条件:精密称取剁椒样品2 g(精确至0.000 1 g)置于20 mL顶空瓶中,加入3 mL饱和NaCl溶液,加入200 μg/mL仲辛醇内标溶液40 μL后密封,于保温套中以50 ℃加热平衡15 min。将已老化好的萃取头插入顶空瓶中,顶空吸附20 min,保温和吸附期间时时振摇,振摇速度为700 r/min。吸附完成后将萃取头插入气相色谱仪进样口,250 ℃解吸5 min。

气相条件:色谱柱为安捷伦石英毛细管柱DB-heavyWAX(30 m×250 μm×0.32 μm);升温程序:初始温度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升温至120 ℃,120 ℃保持10 min,以2 ℃/min升温至200 ℃,后以5 ℃/min升温至240 ℃,保持10 min。载气:高纯氦气(纯度≥99.999%);流速2.0 mL/min;进样口温度250 ℃。

质谱条件:离子源为电子轰击源(electron ionization,EI),电子能量70 eV,离子源温度300 ℃,传输线温度250 ℃,质量扫描范围为m/z40～500。

定性:利用安捷伦MassHunter Workststion Software对原始数据进行处理和分析,结合NIST20(National Institute of Standards and Technology 2020)数据库对挥发性成分进行初步鉴定,再结合相关文献进行图谱解析完成挥发物的最终定性。

定量:以仲辛醇为内标,采用内标法按公式(1)计算每个组分的绝对含量:

(1)

式中:w,单一成分绝对含量,mg/kg;A1,单一成分峰面积;A2,内标峰面积;ρ2,内标质量浓度,μg/mL;V2,内标体积,μL;m,样品质量,g。

1.3.4 挥发性成分香气活度值(odor activity value, OAV)计算

待确定每个挥发性成分绝对含量后,通过化合物嗅觉阈值汇编[18]检索每个挥发性成分的香气阈值,按公式(2)计算挥发性成分的OAV:

OAVi=wi/Ti

(2)

式中:wi,某一化合物的含量,mg/kg;Ti,某一化合物气味阈值,mg/kg。

1.4 数据处理

采用MassHunter Workststion Software Qualitative Analysis(B.07.00 SP 2,美国安捷伦),Microsoft Excel 2016和SPSSPro在线分析软件(https://www.spsspro.com/)对测定数据进行处理和作图。

2 结果与讨论

2.1 传统剁椒感官分析

在发酵过程中,剁椒感官特征发生了较为明显的变化,由表2可知,发酵初期F0样品综合评分最低为58.6分,此时辣椒刚粉碎,水分含量高、色泽艳丽、口感清脆,但发酵尚未开始,剁椒中酸味物质含量低,姜蒜的呈味物质也未充分释放,因此气味单一,辛辣冲鼻,滋味不协调。F50样品的感官评分最高为81.4分,香气、滋味表现最好,发酵时长对剁椒香气和滋味影响较大,随着发酵的深入,辣椒、生姜和大蒜中的挥发性物质得到了充分释放,剁椒发出丰富的果香、蒜香和乳酸发酵香气;滋味咸度适中、酸甜协调,爽口宜人;色泽和脆度的下降,可能与辣椒细胞脱水、果胶含量下降有关[19]。

表2 传统剁椒感官评分Table 2 Sensory evaluation of traditional chopped peppers

2.2 挥发性成分分析

传统剁椒挥发性成分通过GC-MS分析,总离子流图如图1所示,物质出峰时间主要在1～110 min,部分鉴定结果见表3(完整数据见电子增强出版附表https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036204)。

图1 传统剁椒发酵60 d后挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of traditional chopped pepper after 60 d of fermentation

在剁椒发酵期间共分离鉴定出106种挥发性成分,其中烯类38种、酯类22种、醇类10种、醛类7种、硫化物15种、其他类(包括醚类、酮类、酚类、酸类、烷烃类)14种。

烯类为挥发性成分中含量最高的物质,这与崔桂娟[15]对湖南剁椒的研究结果一致,主要来自辣椒和姜,随着发酵时间的延长占比下降并稳定在61.3%左右。姜烯含量最高,约占烯类物质的23.2%,这与石华治等[20]的研究一致。姜烯是一种源自生姜的单环倍半萜烯,具有神经保护潜能、保护心脏和抗癌活性[21-22]。β-倍半水芹烯、α-姜黄烯、β-水芹烯在发酵完成后含量分别增加了27%、23%、33%,而柠檬烯则下降了95%,γ-萜品烯下降至未检出。柠檬烯易发生氧化降解和微生物转化,能转化为香气更浓郁的氧化单环单萜[23]。发酵过程中,烯类由32种增加到33种。

酯类主要由发酵过程中的酸类与醇类脱水酯化和氨基酸降解而来[24],在发酵初期占总挥发性成分的3.8%,发酵结束后增加并稳定在7.3%左右。酯类以乙酯为主,其中反式-4-癸烯酸乙酯含量最高,约占22.1%,是具有白兰地风味和梨香的天然香料。反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和8-甲基壬酸乙酯的含量发酵完成后分别增加了120%、169%、117%和171%。发酵过程中,酯类由18种增加到21种。

硫化物类主要来自大蒜[25],发酵初期占比为19.8%,随后增加并稳定在25.3%左右,其中二烯丙基二硫醚与烯丙基(E)-1-烯基二硫化物互为同分异构体,发酵结束时共占硫化物类的53%。二烯丙基二硫醚存在于洋葱、大蒜等中,呈大蒜特殊气味,可作为食品添加剂,具有抗肿瘤、抗菌作用[26]。发酵过程中烯丙基(E)-1-烯基二硫化物、二烯丙基三硫醚、1,2-二硫酚发酵完成后含量分别增加了20%、138%、56%。发酵过程中,硫化物类由11种增加到15种。

醛类在发酵初期占总挥发性成分的2.7%,随后减少并稳定在1.5%左右。柠檬醛在醛类挥发成分中占比最高,随着发酵时间的延长其占比由87.2%下降到了75.0%。柠檬醛存在于多种植物的叶和果实中[27],在酸性条件下易发生系列转化,转化为单萜醇和芳香化合物。发酵过程中除反式-2,4-癸二烯醛含量增加外,其他醛类成分含量呈下降趋势,如2-己烯醛、香茅醛最终未检出。反式-2,4-癸二烯醛主要来自姜,具有坚果和脂肪香气,对食物的香气起着重要的作用。发酵过程中,醛类由6种减少到5种。

醇类为含量较低的挥发性成分,主要由糖和氨基酸代谢而来[28],含量呈下降趋势,发酵结束时占总挥发性成分的1.0%。醇类中左旋龙脑占比较大,约为36.8%,其发酵60 d时含量与发酵初期相比下降了37%。左旋龙脑主要来自姜,具有松香、樟脑样气味,具有抗细胞凋亡、抗氧化和神经保护作用。芳樟醇在辣椒、姜、蒜均含有,为重要的香料化合物,具有甜嫩新鲜的花香,为剁椒发酵初期的重要香气成分,因芳樟醇易氧化,在发酵30 d后含量下降至未检出。

其他类包括醚、酸、烷烃、酮、酚类,这类物质发酵结束时约占总挥发性成分的3.3%。发酵结束时2-甲基十三烷和二甲醚含量较高,约占其他类挥发成分的33%和30%。β-紫罗兰酮为重要的天然香料,具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种生物活性[29],它天然存在于辣椒和姜中,也可由柠檬醛转化而来,虽然仅占其他类的5.4%,由于香气阈值极低,使其成为剁椒中最为重要的香气成分。

由图2-a可知,挥发物总量呈先升高后下降的趋势,在发酵50 d时挥发物总量最大为506.25 mg/kg,在整个发酵过程中烯类占比最高,硫化物、酯类次之。从图2-b可知,烯类占比显示出先下降再稳定的特点,在发酵第10天开始稳定在63%左右,硫化物类和酯类则呈现为先上升再稳定情况,硫化物类在发酵第10天开始稳定在25%,酯类在第20天时开始稳定在6.9%左右。醇类、醛类和其他类物质相对含量较低,在0.9%～3.6%。

a-各类挥发性成分的含量;b-各类挥发性成分的相对含量

2.3 不同发酵时间香气物质的OAV分析

挥发性成分含量的多少并不能直接反映其对香气贡献的大小,一般通过计算该物质的OAV反映其对香气的贡献。通常认为OAV>1时,该化合物对总体香气可能有贡献价值,OAV越大,则对香气的贡献就越大[30]。部分物质香气阈值和OAV见表4(详细数据见电子增强出版附件),其中OAV>1的关键香气物质有30种,包括酮、烯、硫化物、醇、酚、醛、酯、烷烃类物质。

表4 传统剁椒香气成分的气味描述、香气阈值及OAV Table 4 Odor description, aroma threshold and OAV of aroma components of traditional chopped pepper

在初期的原料中,OAV>1关键香气物质有23种,以β-紫罗兰酮、反式-2,4-癸二烯醛、芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、柠檬烯等成分香气贡献较高,香气特征主要以果香、花香为主;发酵20 d时,OAV>1的关键香气物质有29种,与发酵初期比增加了二甲基三硫醚、丁香酚等成分,香气特征以果香、花香为主,伴有辛辣香、蒜香;发酵40和60 d时,OAV>1的关键香气物质有27种,芳樟醇和2-己烯醛含量下降至未检出,香气特征基本稳定,表现为以果香、花香为主,兼有辛辣香、蒜香和焦香。

2-己烯醛、柠檬烯具有浓郁的水果香气和鲜橙子香气,因其含量随着发酵时间的延长快速下降,因此为发酵初期的主要香气成分。月桂烯具有甜橘味和香脂气,β-水芹烯具有焦香味,二甲基三硫醚呈强烈的薄荷气味和浓烈辛辣香,二烯丙基二硫醚则具有大蒜特殊气味,β-紫罗兰酮和反式-2,4-癸二烯醛呈现浓郁的木香、水果香。综上可知,成熟剁椒的关键香气成分为β-紫罗兰酮、反式-2,4-癸二烯醛、二甲基三硫醚、月桂烯、β-水芹烯、丁香酚、二烯丙基二硫醚,以上物质是剁椒具有浓郁果香、花香和辛辣香的关键。

2.4 不同发酵期关键香气物质的相关性分析

将对香气贡献较大(OAV>100)的11种主要香气成分进行Spearman相关性分析,结果见表5。从表中可知,2-己烯醛与柠檬烯呈极显著正相关,与芳樟醇呈显著正相关,且含量变化趋势均为减小,这可能是由于这3种物质都主要来源于辣椒,辣椒含水量高、易粉碎,挥发成分较易析出,在发酵初期含量较高,随着发酵的深入这些物质不断挥发、氧化降解[31],含量逐渐下降,这一现象与发酵初期香气特征以果香、木香为主的情况相符。β-水芹烯与二烯丙基二硫醚呈极显著正相关,β-紫罗兰酮与丁香酚呈显著正相关,含量同步增加,推测原因是这些成分主要来自姜和蒜。姜蒜结构紧实、纤维丰富、含水量低,挥发成分需逐渐释放,这也与发酵后期香气特征以果香、辛香、蒜香为主的情况相符。β-紫罗兰酮、丁香酚和柠檬醛都主要来自姜,但柠檬醛与β-紫罗兰酮和丁香酚却呈极显著负相关,这主要是因为柠檬醛在酸性条件下稳定性差,易发生氧化降解,转化为β-紫罗兰酮等物质。

表5 主要香气成分相关系数表Table 5 Correlation coefficient table of main aroma components

3 结论

本研究利用HS-SPME-GC-MS技术对不同发酵时间万州传统剁椒中挥发性成分进行了检测,发现挥发性成分由烯类、硫化物类、酯类和少量的醛类、醇类物质组成,物质种类和含量在不同时间均有差异,在发酵初期最少,发酵50 d时挥发性成分种类和含量达到最大并趋于稳定。对结果分析可知,不同发酵时长的剁椒中香气物质、香气特征均存在一定差异。通过计算OAV,筛选出不同发酵时间剁椒的关键香气物质,发现β-紫罗兰酮、反式-2,4-癸二烯醛为各发酵阶段共有的关键香气物质,未发酵时关键香气成分还有芳樟醇、2-己烯醛、月桂烯、柠檬烯,发酵60 d后关键香气物质变为二甲基三硫醚、月桂烯、β-水芹烯、丁香酚,关键香气物质的改变导致香气特征由木香、柑橘香、花香转变为以木香、果香为主伴有辛辣香、焦香和蒜香。发酵过程有利于剁椒中挥发性成分充分释放,使剁椒的香气更丰富。通过本研究,可为自然发酵下传统剁椒的品质提高和标准化生产提供科学依据。