基于网络药理学和实验验证探讨异莲心碱治疗高血压的作用机制

姚梦滢，吴与伦，吴美珠，魏丽慧，周钰婷，彭 军，沈阿灵，4，陈友琴

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建 福州 350122；4.美国凯斯西储大学医学院，俄亥俄州 克利夫兰 44106）

高血压病是我国最常见的慢性疾病，长期高血压会引起心、脑、肾、血管等靶器官损害，严重危害人类健康［1］。血管功能性病变是贯穿高血压全过程的重要病理变化，肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）系统激活的血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）会刺激血管平滑肌细胞发生增殖、迁移等表型转化［2-3］，最终导致血管重构，使高血压进一步加重。因此，防治血管平滑肌的增殖是减轻血管重构、抑制血压进一步升高的重要措施。莲子心具有清心火、泄肝火的功效［4］，其有效成分为生物碱类化合物［5］，异莲心碱是从莲子心中分离出的一种双苄基异喹啉类生物碱［6］，具有抗心律失常、抗氧化的作用［7-8］，但其是否能治疗高血压及其作用机制仍有待进一步研究。

近年来，网络药理学已被广泛应用于中医药的研究［9-10］，可以多维度、多靶点为药物防治疾病提供新视角和新依据［11］。因此，本研究将首先构建高血压模型小鼠以探究异莲心碱对血压的影响，进一步通过网络药理学分析异莲心碱治疗高血压病的靶点和机制，并进行细胞实验验证相关机制，以期为异莲心碱的临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞和动物 大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7R5 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。6～8 周龄的SPF 级C57BL/6 雄性小鼠24 只，体质量（25±3）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级实验室，许可证号：SYXK（闽）2019-0007。本实验已通过福建中医药大学伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2022026）。

1.2 实验药材 异莲心碱购自钥准医药科技（上海）有限公司，纯度＞98%；Ang Ⅱ购自美国Abcam公司；缬沙坦购自美国Sigma 公司。进行动物实验时，药物均用蒸馏水配制；进行细胞实验时，异莲心碱用DMSO 配制。

1.3 实验试剂 胰酶、胎牛血清均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司（货号：25200072、10099141C）；DMEM 培养基（美国Gibco 公司，货号：8123122）；伊红、苏木素均购自北京索莱宝科技有限公司（货号：G1100、G1140）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）一抗和羊抗兔二抗均购自美国CST 公司（货号：4060、4691、4257、7074）；Ang Ⅱ、磷酸化PI3K（p-PI3K）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体均购自英国Abcam公司（货号：120183、ab182651、ab29）。

1.4 实验仪器 CODA 无创鼠尾血压测量仪（美国Kent Scientific 公司）；植入式胶囊微渗透压泵（美国Alzet 公司）；彩色多普勒超声诊断仪（加拿大Visual Sonics 公司）；光学显微镜、全自动石蜡切片机（德国Leica 公司）；CO2培养箱、超净工作台均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；酶标仪（美国Bio Tek公司）；电泳仪（美国Bio-Red 公司）；组织包埋机（中国孝感亚光有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物实验

2.1.1 动物造模与干预 24 只雄性SPF 级C57BL/6小鼠适应性喂养 1 周后，采用随机数字表法分为对照组、模型组、异莲心碱组和缬沙坦组，每组6 只。模型组和给药组采用皮下埋泵法，在小鼠肩胛背部植入含有Ang Ⅱ溶液的胶囊微渗透压泵，以500 ng/（kg·min）持续释放Ang Ⅱ溶液，持续4 周，建立高血压小鼠模型［12］，收缩压≥140 mm Hg 和（或）舒张压≥90 mm Hg 即视为造模成功；对照组在小鼠肩胛背部皮下植入不含Ang Ⅱ的胶囊微渗透压泵，同期泵入生理盐水。根据不同给药途径之间的剂量换算表以及人与各类动物给药剂量的换算关系［8］，异莲心碱组按10.5 mL/（kg·d）予异莲心碱药液灌胃，缬沙坦组按15 mL/（kg·d）予缬沙坦药液灌胃，对照组和模型组予等体积的双蒸水，连续灌胃给药4 周。

2.1.2 尾动脉血压仪检测小鼠血压变化 应用CODA 无创鼠尾血压计分别于造模前1 d 及造模干预后第1、2、3、4 周测量小鼠血压，每次预测试5 次血压，然后正式测量10 次血压，并取平均值。

2.1.3 小动物超声检测小鼠血管功能 使用异氟烷对小鼠进行吸入式麻醉，将腹部涂好耦合剂的小鼠以仰卧位固定于37 ℃恒温加热板上，用小鼠专用超声探头获取主动脉切面图片。操作时密切关注小鼠心律及呼吸变化，如出现心律过低应立刻停止操作。操作结束后，应用Vevo Strain Software（Vevo LAB 1.7.1）软件检测4 组小鼠脉冲波传播速度和血管壁厚度值。

2.1.4 HE 染色法观察腹主动脉病理 干预结束后，使用异氟烷麻醉小鼠，进行脱颈处死，冰上采集小鼠腹主动脉，随后将其置于4%多聚甲醛中固定，然后进行脱水、包埋、切片。用切片机切取4 μm 血管组织置于载玻片上，置于60 ℃烤箱中烘烤1 h 后，进行脱蜡操作，然后用苏木素染色和伊红染色，吹干后封片、拍照。

2.2 网络药理学靶点预测

2.2.1 异莲心碱作用靶点收集 使用中药系统药理学平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获取异莲心碱的蛋白靶标，随后在Uniprot 数据库（http：//www.Uniprot.org/）中将这些蛋白靶标转化成基因名并统一，基因设置为人源性的来源［13］，从而获得异莲心碱的作用靶点。

2.2.2 异莲心碱治疗高血压作用靶点收集 在GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET 数 据 库（http：//www.disgenet.org/）中 以“Hypertension”为关键词，检索出高血压疾病靶点，去除重复项后，与异莲心碱的作用靶点相映射，得到异莲心碱治疗高血压的共同靶点，即作用靶点。

2.2.3 交集靶点互作网络建立与分析 在STRING数据库导入异莲心碱治疗高血压的作用靶点，物种设置为“homo sapiens”，设定置信度＞0.9，其余参数均保持默认设置，获取相互作用关系的信息表。使用Cytoscape 3.7.2 软件，绘制相互作用网络（PPI）图，将异莲心碱治疗高血压的靶点进行可视化分析［14-15］，并确定异莲心碱治疗高血压的核心靶点。

2.2.4 基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将“2.2.3”所示核心靶点导入DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG 富集分析，设置筛选条件为P＜0.005，筛选出KEGG 富集中排名前10 名的通路［14］。

2.3 细胞实验

2.3.1 细胞培养 用含有胎牛血清的DMEM 培养基培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7R5，将细胞放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，镜下观察细胞汇合度至70%时，用胰酶消化后传代，并根据不同实验目的对细胞进行相应处理。

2.3.2 CCK8 法检测细胞生长活力 将对数生长期A7R5 细胞按照1.0×104个/孔铺于96 孔细胞培养板中，培养24 h，根据不同实验目的，加入不同浓度（0.01、0.1、1、10 μmol/L）的Ang Ⅱ溶液和不同浓度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）的异莲心碱溶液，置于培养箱中孵育24 h，避光加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），置于培养箱中继续孵育2 h，应用酶标仪于450 nm 波长下检测各孔吸光度。

2.3.3 造模与干预 将A7R5 细胞分为对照组、模型组和2.5、5、10 μmol/L 异莲心碱组，用胰酶消化后计数，以2 mL/孔均匀接种至6 孔板内，培养箱内过夜，待第2 天贴壁后，除对照组外，其余各组加入1 μmol/L 的Ang Ⅱ溶液进行造模刺激，2.5、5、10 μmol/L异莲心碱组同时分别加入2.5、5、10 μmol/L的异莲心碱溶液进行干预，各组均干预24 h。

2.3.4 Western blot 检测A7R5 细胞PCNA、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表达量 干预结束后提取蛋白，经电泳、转模、封闭后，置于p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3k（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中孵育过夜，TBST 清洗后置于相对应种属的二抗（1∶5 000）中孵育，TBST 清洗后进行化学发光显影。

2.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内不同时间点比较采用重复测量方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

4 结 果

4.1 动物实验结果

4.1.1 4组干预期间血压指标和体质量比较 与对照组比较，模型组干预1、2、3、4 周的收缩压、舒张压和平均动脉压明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，异莲心碱组和缬沙坦组干预1、2、3、4 周的收缩压、舒张压、平均动脉压明显降低（P＜0.05）。4 组小鼠干预1、2、3、4 周的体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 4 组干预期间血压指标和体质量比较

4.1.2 4 组脉冲波传播速度和血管壁厚度比较 与对照组比较，模型组脉冲波传播速度和血管壁厚度均明显提高（P均＜0.05）；与模型组比较，异莲心碱组和缬沙坦组脉冲波传播速度和血管壁厚度均明显降低（P均＜0.05）。见图2、图3。

图2 4 组主动脉超声心动图

图3 4 组脉冲波传播速度和血管壁厚度比较

4.1.3 4 组腹主动脉病理形态 与对照组比较，模型组小鼠腹主动脉管壁厚度明显增厚；而经异莲心碱和缬沙坦干预后，小鼠腹主动脉管壁增厚程度明显改善。见图4。

图4 4 组腹主动脉HE 染色图（×40）

4.2 网络药理学结果

4.2.1 异莲心碱潜在靶点与高血压的作用靶点交集 通过检索得到异莲心碱作用靶点105 个，高血压疾病作用靶点9 317 个，将异莲心碱作用靶点与高血压疾病作用靶点相映射，得到90 个共同基因。见图5。

4.2.2 PPI 网络图分析结果 如图6 所示，PPI 网络图中共有45 个节点（即共同作用靶点）74 条节点连接线。将在STRING 数据库中获得的PPI 网络数据导入Cytoscape 3.7.2 软 件［16］，节 点 平 均 度 值 为3.288 888 889，其中磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α亚型（PIK3CA）、酪氨酸蛋白激酶（LYN）、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK8）、蛋白激酶Cδ 型（PRKCD）、B 淋巴细胞酪氨酸激酶（BLK）、血小板衍生生长因子受体（PDGFRP）、酪氨酸蛋白激酶（FGR）、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAF1）、酪氨酸蛋白激酶（ABL1）、蛋白激酶C β 型（PRKCB）、血栓素A2 受体（TBXA2R）、酪氨酸蛋白激酶（SYK）、蛋白激酶C θ 型（PRKCQ）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（PDPK1）等14 个节点度值高于平均值，以上节点为异莲心碱治疗高血压的核心靶点，见图6。

4.2.3 KEGG 通路富集分析 经筛选得到81 条信号通路，且根据富集通路涉及基因数的大小，由大到小进行排名，筛选出排名前10名的通路，见图7。

图7 KEGG 通路富集分析图

4.3 细胞实验结果

4.3.1 不同浓度Ang Ⅱ和异莲心碱对A7R5 细胞活力的影响 与0 μmol/L AngⅡ比较，0.01、0.1、1、10 μmol/L AngⅡ干预A7R5 细胞后细胞活力明显提高（P＜0.05）；与0 μmol/L 异莲心碱比较，20、40、80 μmol/L异莲心碱干预A7R5细胞后细胞活力明显降低（P＜0.05）。因此，本研究选择2.5、5、10 μmol/L的异莲心碱和1 μmol/L 的Ang Ⅱ进行后续实验。见图8。

图8 不同浓度AngⅡ和异莲心碱对A7R5 细胞活力的影响

4.3.2 5 组A7R5 细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和PCNA 蛋白表达量比较 与对照组比较，模型组PCNA蛋白表达量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，10 μmol/L 异莲心碱组PCNA 蛋白表达量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均明显降低（P＜0.05）。见图9。

图9 5 组A7R5 细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和PCNA 蛋白表达量比较

5 讨 论

高血压属中医学“头痛”“眩晕”的范畴［17］，其核心病机为肝阳上亢，治疗以清心火、泻肝火为主［18］。有研究显示，Ang Ⅱ对血管结构和功能具有重要影响［19］，在高血压情况下，Ang Ⅱ会大量释放，使血管中膜的血管平滑肌细胞发生由收缩性向合成型演变的表型转换，发生合成型转变的血管平滑肌细胞在血管中膜异常增殖，导致血管壁增厚，血管腔隙变窄，又进一步加重高血压［20］，成为恶性循环。因此，寻找抑制血管平滑肌增殖的潜在机制是治疗高血压的思路之一。动物实验结果表明，异莲心碱可以明显降低高血压模型小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压，改善高血压小鼠的血管功能，促进血管壁增厚。

进一步利用网络药理学筛选出异莲心碱和高血压的疾病共同靶点90 个，其中排名第1 的靶点是PIK3CA，在排名前10 的信号通路中，也富集到了PI3K/Akt 信号通路，提示PI3K 及其下游的Akt 通路可能是异莲心碱调控高血压的途径之一。在这条通路中，包含PIK3CA［21-22］、SYK［23］、CDK2［24］等多个与增殖相关的靶点，这些靶点与PCNA 关系密切，如PCNA 能够与Cyclin A-CDK2 形成复合物，并连接CDK2 及其下游的通路［25］，发挥促增殖的作用。因此，PCNA 作为DNA 聚合酶δ 和ε 的辅助因子［26］，可以评价细胞增殖情况［27］，其表达水平的高低可以反映血管平滑肌的增殖活性［28-29］。研究发现，受Ang Ⅱ刺激后，PI3K 被激活发生磷酸化［30］，活化的PI3K 会使磷脂酰肌醇2（PIP2）转化为磷脂酰肌醇3（PIP3）［31］，从而调节包括细胞增殖在内的多种胞内活动［32］；同时，当细胞信号传导至Akt，Akt 也会在Ser473 位点发生磷酸化并激活下游的靶标蛋白［33-34］，发挥促进细胞生长、增殖和凋亡的作用［35］。

体外实验发现，异莲心碱能够降低Ang Ⅱ刺激后血管平滑肌细胞中PCNA、p-PI3K、p-Akt 的表达，并抑制PI3K/Akt 通路的激活，进一步提示异莲心碱可能通过调节PI3K/Akt 途径及PCNA 的表达改善平滑肌增殖来治疗高血压。但本研究对于机制的探讨仅停留在蛋白层面，后续研究会从基因水平更深入地探讨异莲心碱调控高血压导致的血管平滑肌的具体机制。

综上，异莲心碱调控高血压具有多靶点、多途径的独特优势，异莲心碱可能通过PI3K/Akt 通路改善血管平滑肌细胞增殖治疗高血压。