脐血来源干细胞治疗早产儿疾病临床研究进展与挑战

李 芳 王 利

重庆医科大学附属妇女儿童医院儿科（重庆 401120）

近年来，随着我国围生医学和新生儿医学迅速发展[1]，越来越多的早产儿得以存活，早产相关疾病成为新生儿死亡的重要原因[2]。早产儿出生胎龄的不断提前，早产相关疾病的发生风险也日益增加，如支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）、脑室内出血（intraventricular hemorrhage，IVH）、脑白质损伤（white matter injury，WMI)、坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）等，极大影响存活早产儿的远期生存质量[3]。常规治疗对于已受损组织的修复以及器官功能的恢复往往作用有限。干细胞可分化为各种组织，并具有免疫调节、改善微环境作用，还可以通过旁分泌作用产生大量有益的细胞因子、生长因子和外泌体，有助于组织修复[4]，为临床棘手的早产儿并发症治疗带来了新的曙光。干细胞来源广泛，其中脐血来源的干细胞（umbilical cord blood，UCB）具有获取方便、不损害母体与胎儿、含量丰富、分化潜能高、免疫原性低、安全性高、低温保存时间长等优势[5-6]。因此，脐血来源的干细胞移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）长期以来成为临床研究的重点。本文将围绕UCBT在治疗早产儿疾病的临床研究现状和面临的挑战进行探讨。

1 UCB的组成和UCBT类型

1.1 UCB的组成

UCB 含有间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitors，EPCs）、淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等[7-8]。MSCs 是一类多能干细胞，具有分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞谱系的潜力[9]，还可分泌促进组织修复、调节免疫的生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡[10]。MSCs 在UCB的含量较少，要提取到适用的MSCs，至少需要采集90 mL脐带血且自采集到细胞提取的时间间隔不能超过2 小时[11]。与骨髓或外周血来源相比，UCB 来源的HSCs 更不成熟，在接受外来抗原刺激时增殖能力更强[12]。HSCs 可进一步分化成骨髓系统的各种血细胞和淋巴系统的细胞[13]。EPCs 是血管内皮细胞的前体细胞，它们的功能主要是参与出生后缺血组织的血管生成和血管损伤后的修复[14]。淋巴细胞是免疫反应的核心。与成人外周血相比，UCB 的B淋巴细胞占比类似、T淋巴细胞占比较少[15]。UCB来源的淋巴细胞表型和功能上都不成熟。单核细胞是血液中循环的未成熟吞噬细胞[16]，单核细胞可以分化为树突状细胞、巨噬细胞和成骨细胞。单核细胞作为抗原呈递免疫细胞，它们可以吞噬和降解微生物和颗粒物[17]。目前UCBT 治疗新生儿疾病，根据移植成分不同分为：脐带血间充质干细胞移植（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、脐带血单个核细胞移植（cord blood-mononuclear cells，CBMNCs）和全脐带血移植治疗。

1.2 UCBT类型

1.2.1 脐带血间充质干细胞移植 MSCs 因易提取、体外扩增能力强、低免疫原性和强大的分化潜力而独具优势[18-19]，一直是新生儿细胞治疗研究的重点。目前，国外商品化的脐带血来源MSCs已经用于临床研究。欧盟资助的PREMSTEM 联盟致力于对商品化的MSCs通过体内和体外筛选进行全面测试，将进一步促进临床转化[20]。近年来，MSCs细胞外囊泡的治疗作用逐渐被发现[21-22]。

1.2.2 脐带血单个核细胞移植 CB-MNCs是将人脐带血采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞[23]，包含丰富的造血干/祖细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、淋巴细胞、单核细胞等[24]。CB-MNCs 移植治疗脑损伤、支气管肺发育不良等研究较多，但究竟是哪种细胞发挥作用尚不清楚。CB-MNCs具有自我更新、多向分化为各种细胞表型的功能，其外分泌功能还参与了组织修复和免疫调节[24]。自体CB-MNCs可以在出生后数小时或数天内方便且安全地移植，其数量充足，不需要扩增即可产生治疗效果。

1.2.3 全脐带血移植 全脐带血移植于1989年报道可用于治疗儿童范可尼贫血，此后被广泛用于造血系统疾病的骨髓重建[25]。脐带血干细胞的数量异常和早产儿并发症相关[26-27]，且脐带血富含胎儿血红蛋白和大量的生长因子、趋化因子，因此有学者采用全脐带血移植以充分发挥脐带血的优势。研究发现，对早产儿采集、制备和储存脐带血是方便可行的[28]，临床上已经有应用全脐带血移植治疗早产儿贫血的I期研究。

2 UCBT在新生儿疾病治疗中的临床应用

2.1 BPD

BPD 是一种由多种因素综合作用引起的疾病，其发病率始终居高不下。早产儿未发育成熟的肺在机械通气、感染等因素的影响下发育受阻，导致肺泡与毛细血管数量减少、发育不良或受损伤后修复障碍。尽管肺表面活性物质使用、肺保护性通气策略及其他药物应用于BPD的预防和治疗，但并未根本性解决导致BPD发病的肺泡和血管发育受阻和损伤后的修复障碍问题。干细胞的作用特点为UCBT 用于BPD 治疗奠定基础。近年来，各国均开展了大量UCBT 治疗BPD 的临床研究，一些研究目前已经进入III 期临床研究阶段，其安全性、可行性和有效性均得到了初步验证。

2.1.1 UCBT 治疗BPD 的安全性和可行性 韩国Chang 等[29]和杜克大学Powell 等[30]在超早产儿接受低剂量（1×107/kg）或高剂量（2×107/kg）气管内注射人脐带血来源的MSCs 移植，未发现与移植相关的不良的结局。国内重庆市儿童医院Xia等[31]和越南Nguyen 等[32]以人源脐血MSCs静脉注射治疗重度BPD患儿，随访未发现移植相关不良事件。

2.1.2 UCBT治疗BPD的有效性 Ahn等[33]2021年发表了Ⅱ期RCT临床研究结果，33例超早产儿接受气管内移植人脐带血来源的MSCs 1×107/kg；和对照组相比，干细胞移植组的气道灌洗液的炎症因子水平显著下降。在亚组分析中，23～24 周组的严重BPD发病率显著降低，干细胞移植后的患儿计划随访至纠正年龄5岁，该研究结果尚未发表。同时研究者团队正在招募23～24 周患儿，开展更大规模的Ⅱ期RCT 试验。广东省妇幼保健院Ren 等[34]在早产儿生后8小时内静脉注射自体脐带血单个核细胞（ACBMNCs，5×107/kg），试验组显著减少了机械通气时间和需氧治疗时间。2023年广东省妇幼保健院Zhuxiao等[35]在62例极早产儿生后24 h静脉注射一剂ACBMNCs（5×107/kg），ACBMNCs注射组中重度BPD 发病率显著降低，呼吸机拔管率更高；在校正18～24月龄时发育迟缓的发病率更低，CD4+T细胞、Treg细胞比例显著增加，IL-10水平显著升高，TNF-α 和CRP 水平显著降低。该团队旨在探索自体脐带血单个核细胞移植预防超早产儿BPD的多中心Ⅲ期随机对照RCT 研究（NCT 04440670）正在开展中。

2.2 新生儿神经系统疾病

极低出生体重儿（VLBW）救治存活率的提高使得远期神经系统发育障碍问题逐渐凸显。约10%的VLBW 患者伴随脑瘫，高达50%的VLBW 患儿存在需要干预的学习困难或者行为异常[36]。尽管亚低温治疗对HIE、IVH、WMI等常见新生儿脑损伤有效，但是亚低温只能达到部分神经保护作用，对已造成损伤的神经系统无修复功能[37]，且只能用于治疗（近）足月HIE。

目前应用干细胞治疗新生儿脑损伤的研究主要集中于IVH 和HIE，且尚处于安全性研究阶段。Ahn 等[38]研究发现9 例胎龄（26.1±2.1）周的患儿在诊断IVH-IV ?后1 周内脑室内接受移植单次、低剂量（5×106/kg）或高剂量（2×107/kg）人脐带血来源的MSCs 是安全和可行的。Cotton 等[39]发现予以亚低温的HIE 患儿，予以自体脐带血细胞移植是可行的，干细胞移植+亚低温组和仅接受亚低温组1 岁时Bayley III 评分≥85 为13/18（74%）对19/46（41%），移植后1 年内未发生相关不良事件。日本Tsuji等[40]在发生重度窒息接受亚低温治疗的患儿中生后12～72 h 内共接受3 次静脉输注自体脐带血后，未发生相关移植不良事件。目前进行中的临床试验NCT 01284673 研究新生儿窒息的脐带血干细胞的特点，目前已经完成研究，尚未发表结果。ACTRN 12619001637134 旨在探索，超早产儿采集自体脐带血和静脉输注单个核细胞的安全性和可行性[41]。

2.3 NEC

干细胞治疗NEC 的研究目前绝大多数仍处于动物实验阶段。Akduman等[42]2019年发表1例室上性心动过速相关的新生儿坏死性小肠结肠炎患儿临床病例报告，该患儿术中发现肠道广泛坏死，切除60 cm坏死、穿孔肠道后，静脉移植1×107/kg脐带血来源同种异体MSCs，移植后肠道血供恢复，逐步建立全肠道喂养；该患儿1 岁时的体格和神经发育和同龄儿水平相当。

表1 UCBT在新生儿疾病的临床研究

2.4 早产儿贫血

Rudnicki 等[28]开展了一项纳入14例＜32周出生时贫血早产儿的临床研究，其中5 例接受自体脐带血移植，整个脐带血输注过程中和随后的48小时内，氧饱和度显著增加，说明早产儿中进行全自体脐带血移植的总体安全性和耐受性。Kotowski等[43]在5 例生后贫血的早产儿在生后5 天内接受单次脐带血输注，15例患儿作为对照组接受同种异体的红细胞输注，脐带血输注组发生IVH 的比例是40%，低于对照组86.7%，推测自体脐带血输注在这个小样本研究中是可行的、安全的。

2.5 先天性心脏异常

Burkhart等[44]对10例左心发育不良综合征患儿接受II 期缓解手术的同时心肌内注入（1～3）×106自体脐带血来源的MNCs，其中1例发生干细胞注射相关不良事件注射部位心外膜出血，需要简单缝合，手术和干细胞移植后随访6个月，未发现严重MNCs移植不良反应，且手术+干细胞移植（7 例）的婴儿体重增长、右心室分数面积变化和射血分数方面相较于既往单纯手术对照组均有显著改善。

3 脐血来源干细胞临床应用面临的挑战

尽管UCBT为早产儿疾病治疗带来了新的曙光，然而迄今为止的临床研究虽然涉及多种脐带血来源干细胞、多种移植途径、多种早产儿疾病，但是多为前期安全性研究，研究设计多为小样本单中心研究。见表1。UCBT治疗早产儿疾病的临床应用中干细胞来源选择、移植的方案包括时机、途径、剂量、移植成分、与其他治疗措施的相互作用以及潜在风险等问题亟待解决。

3.1 自体还是异体脐带血移植

自体脐血干细胞采集是理想的移植材料，因为没有移植物抗宿主病的风险、且通常不存在伦理问题。然而自体脐带血移植可能存在采集量不足的问题，尤其是早产儿经延迟脐带结扎处理后，如存在绒毛膜羊膜炎等产科并发症将进一步限制自体UCB 输注[45]。NetCord-FACT 建议只采集没有并发症的分娩时孕周＞34 周婴儿的脐带血。胎龄越小，自体脐带血采集量越低。Segler 等[46]研究中42%的＜30 周早产儿无法采集到足够的脐带血。此外，自体干细胞的采集、制备和移植均需要时间，可能导致错过了BPD和HIE等最佳的治疗时间窗。

目前Ⅰ期和Ⅱ期的异体UC-MSCs 在新生儿疾病移植中已经证实是安全可行的。异体UCB-MNCs移植治疗儿童脑瘫中正在开展临床研究[47]。脐带血来源的其他干细胞的体外扩增和异体移植，比如脐血来源的造血干细胞、内皮祖细胞目前尚处于动物实验阶段中[48-49]。

3.2 移植的最佳方案：时机、剂量和途径

关于移植的时机，目前仅有动物研究数据提示治疗时间窗为损伤早期。研究表明，在药物所致肺纤维化模型中，在给药同时予以MSCs 可减轻肺纤维化，而给药后1周作用不明显[50]。另有研究表明，胎羊经历缺氧缺血事件后，和晚期移植（缺氧缺血后5 d）相比，早期移植（缺氧缺血后12 h）可显著减轻脑白质损伤[51]。关于移植的剂量，自体UCBMNCs移植治疗脑瘫的RCT研究发现：高剂量移植组（20×106/kg）的运动功能改善比低剂量移植组（10×106/kg）更好[52]。而前述多个临床研究进行了不同剂量的研究，着重关注了高剂量的安全性，而没有比较高低剂量之间是否存在临床结果的差异。目前UCBT 的途径主要包括气管滴入、静脉注射和腹腔注射，而治疗途径又将影响治疗剂量，因为直接向损伤部位注射低剂量比静脉注射高剂量要多出5 倍[53]。因此，在未来的临床试验仍需解决在特定的新生儿疾病中，最佳的移植时机、移植剂量和移植途径。

3.3 UCBT与其他治疗措施的相互作用

早产儿常常需要多种措施治疗，而这些治疗措施与UCB 可能存在相互作用。如一氧化氮和促红细胞生成素与MSC 治疗有协同作用[54-55]，可以增强BPD 模型中的促血管生成和抗纤维化作用。而对HIE的研究表明亚低温和间充质干细胞可以具有协同作用[55]或拮抗作用[56]。这些研究表明，要将UCBT治疗从可控制的实验室环境转向复杂和高度可变的临床环境需要特别谨慎。

3.4 细胞治疗的标准化

对于细胞的治疗需要解决的一个重要问题是要有一个稳定的大量细胞供应，其疗效是持续一致的。由于不可能同时产生大量的细胞来满足临床需求，因此当细胞从不同的来源和不同的时间获得时，保持其一致的性能将是一个挑战。因此，标准化产生具有相同功效的细胞的培养技术是至关重要的。基于MSCs 的治疗面临的另一个挑战是，确定当细胞传代以增加细胞数量时，骨髓间充质干细胞的治疗效果是否保持一致。

3.5 干细胞治疗的远期风险

由于干细胞具有多向分化潜能，干细胞治疗的远期潜在的致癌转化一直以来是影响其临床应用安全性的一个关键因素。目前有不同的研究结果，有研究表明，长期培养的骨髓来源的MSCs 容易发生自发性恶性转化[57]，但最近的一项研究评估了hUBC-MSCs 在NOD SCID 小鼠模型中肿瘤发生中的作用，发现在NOD SCID小鼠中，hUC-MSCs没有致瘤性，也没有显著促进或抑制实体或血液学肿瘤的生长或转移[58]。因此，所有接受干细胞治疗的患儿需要长期随访并且在治疗前充分告知家属潜在的风险。

4 结语

当前早产儿疾病，特别是超/极早产儿相关疾病的有效治疗对于新生儿科医师来说仍是巨大的挑战。随着对UCBT基础和临床研究的深入，大量的临床研究已经初步证实其在一些特定早产儿疾病治疗中的安全性和潜在有效性，未来还需要在细胞治疗来源选择、治疗机制、细胞治疗的标准化管理和精准治疗方案等方面开展进一步的基础和临床研究以实现其在临床实践中发挥积极作用。