健脾化痰方改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用*

王 潇 严茂祥 何蓓晖 陈芝芸

浙江中医药大学附属第一医院 浙江杭州 310006

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是代谢综合征在肝脏的一种临床表现，是单纯性脂肪性肝炎发展至肝纤维化、肝硬化和肝癌的重要阶段[1-3]。NASH 的发病机制虽未完全明确，但“二次打击”学说现阶段仍处于主导地位。NASH 现有的防治手段除了严格强化生活方式外，尚无其他明确有效的治疗方法。近年来的研究发现，线粒体功能紊乱在NASH 的病理过程中起着重要作用，及时清除细胞内损伤的线粒体对于保护肝细胞具有重要作用。健脾化痰方由二陈汤和四苓散组成，我们的前期研究发现，健脾化痰方能够纠正NASH 大鼠脂质代谢紊乱，减轻肝组织炎症损伤，防止NASH 的进一步发展。本研究从调控自噬来探讨健脾化痰方改善蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）诱导的NASH小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠40 只，体质量约20g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SYXK（浙）2018-0012；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。

1.2 健脾化痰方组成：陈皮、半夏、泽泻各15g，茯苓、白术、猪苓各9g，炙甘草5g，生姜3g，乌梅1.5g，均为颗粒剂。

1.3 主要试剂和仪器：BCA 蛋白质定量试剂盒（biosharp）、总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；沉默信息调节蛋白（SIRT1）、p62、Beclin-1抗体（Immunoway 公司）；LC3 抗体（proteintech 公司）；数字病理切片扫描系统（ZEISS 公司）；生物样品匀质器（precellys）；酶标仪（美国BioTek 公司）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司）。

1.4 实验方法：40 只雄性C57BL/6J 小鼠随机分为5组，正常组，MCD-NASH 模型组，健脾化痰方低、中、高剂量组，每组8 只。正常组普通饲料喂养，其余4 组喂养MCD 饲料，连续4 周。造模同时药物干预组每天分别以11.76g/kg·d、23.29g/kg·d、46.58g/kg·d 的健脾化痰方灌胃，正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃。实验结束前12h小鼠禁食，称重，摘眼球放血法采血，全自动生物仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）含量；取肝脏组织，称重后，部分肝组织冰冻切片油红O 染色；部分甲醛固定，石蜡包埋，常规脱水透明，HE 和Masson 染色，数字病理切片扫描系统观察肝组织病理变化并拍照。提取肝脏组织蛋白，免疫印迹法检测肝组织中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白表达水平，ECL 化学发光凝胶成像系统拍照并分析。

1.5 统计学分析：采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数间的比较采用t检验；多个样本间的比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量及肝指数的变化：MCD饮食喂养4周后小鼠较正常组小鼠体质量明显下降，肝指数与正常组相比明显增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001）。健脾化痰方各组与模型组比较，体质量无统计学差异（P＞0.05），肝指数呈下降趋势。见图1。

图1 小鼠体质量和肝指数情况

2.2 健脾化痰方对NASH 小鼠血清ALT 和AST 的影响：生物化学法检测血清ALT和AST，结果显示，模型组小鼠血清ALT和AST水平显著升高（P＜0.0001）；健脾化痰方中和高剂量组ALT和AST含量与模型组比较明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。见图2。

图2 健脾化痰方对NASH小鼠血清ALT和AST水平的影响

2.3 NASH 小鼠血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 含量：MCD饮食喂养小鼠4 周后，检测发现血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 的水平与正常对照组小鼠无明显差异，健脾化痰方干预各组也均无变化。见图3。

图3 小鼠血清中CHOL 、TG、HDL-C和LDL-C水平

2.4 健脾化痰方对小鼠肝脏组织病理的影响：与对照组相比，肝组织油红O染色观察到模型组小鼠肝组织内有大量的脂滴大泡，健脾化痰方能有效减少肝组织的脂肪沉积。HE染色和Masson染色结果显示，模型组肝组织结构紊乱，出现不同程度的炎症细胞浸润和纤维化，而健脾化痰方能部分改善肝组织的病理改变。见图4。

图4 肝组织油红O染色、HE染色和Masson染色（×200）

2.5 健脾化痰方对小鼠肝组织中自噬相关蛋白表达的影响：免疫印迹法检测结果显示，模型组肝组织中自噬活性正相关蛋白SIRT1、Beclin-1和LC3水平降低，负调控蛋白p62表达增高；健脾化痰方干预后SIRT1、Beclin-1和LC3蛋白表达上调，p62蛋白水平下降（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。见图5。

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在我国已成为仅次于病毒学肝炎的第二大肝脏疾病，严重危害人类健康，在年轻人中的发病率也逐年升高[4]。NASH 是NAFLD 疾病发生的初期阶段，如果没有得到有效的控制，约有20%的患者会发展为肝硬化[5，6]。因此，在疾病早期延缓或阻止其进一步发展至关重要，能有效改善NAFLD患者的生活质量及预后。

MCD 诱导的NASH 动物模型是目前研究NASH 的经典模型之一[7]。本研究结果通过MCD 建立的NASH 模型小鼠与正常组小鼠相比体质量明显下降，肝指数显著增高，而血清中TG、CHOL、LDL-C 和HDL-C 水平并没有明显差异，这与以往研究中NASH的造模结果一致。MCD诱导NASH 小鼠模型的原理与高脂饮食所致的NASH 不同，这是由于在MCD 诱导NASH 模型中胆碱的缺乏会造成肝内极低密度脂蛋白合成抑制，促使肝细胞内甘油三酯运出受阻，导致肝细胞内甘油三酯大量累积引起脂肪变性，进而激活脂质过氧化和氧化应激反应。而蛋氨酸缺乏损害细胞的氧化屏障，进一步加重肝脏脂肪变性和炎症反应。因此，MCD 脂类代谢紊乱主要体现在肝脏，而不会出现NASH常见的全身性表现，如肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等。

ALT 和AST 是肝细胞内非特异性的功能酶，在正常情况下人体血清中含量较低。当肝细胞受到炎症反应素刺激时，细胞膜通透性增加，ALT和AST从细胞内释放到血液中。因此，血清中ALT 和AST 的水平在一定程度上能够反映肝细胞功能及其炎性损伤程度，通过其浓度变化可判断疾病的进展、疗效及预后等情况。本研究结果显示，MCD 模型小鼠血清ALT 和AST 水平与正常组相比明显升高，同时肝组织病理观察到肝细胞中脂质沉积明显增多，有大量炎症细胞浸润和部分纤维化。这也表明我们建立的动物模型能很好地模拟NASH在肝脏组织中的病理特征。

中医学认为脾虚失运、湿化为痰、痰瘀郁热，积损肝络是NASH 发病的关键因素，脾虚痰湿是本病发生发展及预后的核心环节。通过健脾气、化水湿、截痰浊、助消导、祛血瘀可以达到治疗脂肪肝的目的[8-11]。健脾化痰方中的陈皮、半夏和茯苓可以健脾消痰；泽泻、白术、猪苓具有健脾利湿、利水除湿之功效。诸药配合，可健脾化痰而不伤正。本研究结果表明，健脾化痰方干预后NASH 小鼠肝指数下降，血清转氨酶水平降低，肝组织脂肪变性、炎症反应和纤维化均明显减轻。

研究表明，NAFLD 患者肝细胞内自噬活性下降，肝脏损伤程度与其自噬受损程度密切相关[12]。SIRT1 是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶（HDACs），能够调节脂质代谢、减轻炎性反应和氧化应激损伤[13]。近来研究发现，细胞中SIRT1 过表达后，细胞自噬水平会增高。而敲除SIRT1 后，自噬水平显著下降。同时相关研究也相继证实，SIRT1 可通过去乙酰化作用对自噬相关蛋白功能发挥调控作用，在自噬的调节中起着关键性作用[14]。本研究结果进一步表明，健脾化痰方能上调NASH 小鼠肝细胞中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白水平，同时下调p62蛋白表达。因此，本研究结果提示，健脾化痰方可能是通过激活SIRT1，诱导自噬发生，保护肝细胞损伤，从而达到防治NASH的功效。