采食赭曲霉毒素A 污染日粮猪只的可食用组织及生物体液中OTA 残留比较

朱秋凤 ，张一诺 ，王梦晨 （编译）

（1.中国农业大学动物科技学院动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.禾丰食品股份有限公司，辽宁 沈阳 110164）

赭曲霉毒素A（OTA）是一组由曲霉菌（较温暖地区）或青霉菌（较寒冷地区）等真菌产生的次级代谢有毒产物，广泛污染多种农作物（Peraica 等，1999；Marin 等，2009）。环境温度和水分含量是造成谷物收获和储存期间OTA 污染的主要因素（Abramson等，1987）。早期研究已经引起人们对OTA 污染农作物、饲料以及人类和动物接触该污染物的关注（Petzinger and Weidenbach 2002；Binder 等，2007；PfohlLeszkowicz和 Manderville2007；Amezequ 等，2009）。

过去几十年文献数据显示，在中欧和东南欧地区，OTA 分布、检出率、阳性率和浓度存在季节性变化（Pepeljnjak 等，2008；Milićević等，2009；Stoev 等，2012）。欧盟委员会2006/576/ EC（欧盟委员会2006）规定了动物饲料中OTA 最大限量。除了植物来源的饲料和食品外，OTA 也可能残留在肉类和畜禽内脏中，其出现是由于动物摄入OTA 污染的谷物和饲料导致的。人会通过多种途径接触OTA，其中之一是食用动物源性产品，如腊肉制品，这是一种传递效应，即动物采食自然污染饲料后转移（Pleadin 等，2013；Perši 等，2014）。另一种途径是腊肉制品在发酵过程中其表面的二次污染和霉菌生长（Amezequeta 等，2009；Pleadin 等，2013；Markov 等，2013；Pleadin 等，2015 a，b）。

国际癌症研究机构（IARC）将OTA 列为2B 级人类致癌物。此外，OTA 可引起线粒体损伤和氧化应激，刺激脂质过氧化，干扰氧化磷酸化，可能出现肾毒性、神经毒性、突变性、致畸性和免疫毒性（Mally和 Dekant，2005；Abrunhosa 等，2010；Gupta，2011）。多项研究表明，OTA 与巴尔干地区地方性肾病（巴尔干地方性肾病）发展有关（Castegnaro 2006；Milićević 等，2009）。OTA 及其代谢物毒性作用取决于许多因素：如剂量、采食时间和采食途径（Pfohl-Leszkowicz 和Manderville， 2007）。

研究显示，猪只对OTA 特别敏感，毒素在肾脏富集量最高，其次是肝脏和肌肉组织，脂肪组织中最低（Gareis 和Scheuer， 2000；Lusky等，1993；Pietri 等，2006；Persi等，2014）。OTA 主要通过胃肠道吸收，易与血浆蛋白结合（导致其在体内半衰期较长），而肾小球滤过率有限。OTA 通过转运蛋白穿过肾小管膜，并通过尿液排出（Gareis和Scheuer，2000）。体内重吸收作用减慢了其排泄速度，可能导致毒素在肾脏中累积，从而增加其毒性（Pfohl-Leszkowicz 和 Manderville，2007；Dietrich 等，2005）。

过去研究仅涉及部分组织或生物体液，本研究目的是比较猪只采食受OTA 污染饲料后各种可食用组织和生物体液中OTA 水平。本试验中动物摄入OTA 量与可能自然发生的OTA 摄入水平相对应。采用半定量免疫测定法（ELISA）和高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FD）测定猪只可食用组织和生物体液中OTA水平。

1 材料和方法

1.1 标准及试剂

OTA 标 准 品 购 自Acros Organics（吉尔，比利时）。所有其他化学品均为分析纯级，而所有溶剂均为高效液相色谱（HPLC）纯级。标准溶液分别制备为浓度10 000 ng/mL 和 20 ng/mL 的水溶液和工作溶液。OTA 检测采用R-Biopharm（Darmstadt，Germany） 公司生产的生产的“BRIDASCREEN®赭曲霉毒素A30/15”ELISA 试剂盒。该试剂盒包括一个96 孔OTA 包被反应板，以及OTA 标准品溶液（0、50、100、300、900 和1 800 ng/mL），偶联物（过氧化物酶偶联OTA），底物/显色剂溶液（四甲基联苯胺），终止液（1 mol/L），稀释缓冲液和洗涤缓冲液（10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）。

用 于HPLC-FD 分 析 样 品制备的磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH=7.4±0.1）是通过在去矿化水（MilliQ 系 统，Millipore， 美国Milford）中溶解NaCl（8.0 g）、Na2HPO4（1.16 g）、KH2PO4（0.2 g）和KCl（0.2 g）来准备的，定容获得总体积为1 L 的缓冲液。OTA 洗脱采用甲醇/乙酸溶液（98 ∶2，体积比）。HPLC-FD 方法中使用的流动相由乙腈/水/异丙醇/乙酸溶液组成， 各组分比例为46 ∶46 ∶6 ∶2。用于OTA 测定的所有其他化学试剂和溶剂分别为分析级和HPLC 级。

1.2 动物饲养管理和样本采集

试验选用10 头体重63 ～68 kg杂交品系（Zeger）小母猪。试验分为2 组，试验组为5 头猪只在育肥期连续4 周（28 d）饲喂OTA 强化饲料（250 μg/kg 饲料）；其余5 头猪只作为对照组，即未接触OTA 的组。对照组和试验组猪只在相同条件下饲养，每天采食相同饲料量和自由饮水。28 d 屠宰后，采集血液和尿液，以及肌肉、脂肪、脑、肝、肾、心、肺和脾组织。总共从10 头猪身上取到检测样本100 份。将所有样本分别分成两份，使用ELISA和HPLC-FD 方法进行OTA 分析（共200 个子样品，100 个来自试验动物，100 个来自对照动物）。通过2 000×g 离心5 min 分离血清后，将所有样品储存在-20 ℃，用于OTA 分析。

1.3 ELISA 样品制备

采用Perši 等人（2012、2014）在早期研究中血清、尿液、肝、肾、脑、肺、心脏和脾脏样本制备方法。

将1 g 肌肉和脂肪组织均质样品用6 mL 乙酸乙酯稀释，充分混合30 s。然后使用振荡器将样品再摇15 min。加入0.5 mL 1 mol/L 的H3PO4，搅拌15 s，后再搅拌15 min。离心后，转移上清液（乙酸乙酯层），加入6 mL 乙酸乙酯重复提取过程。随后，将3mL 0.26 mol/L NaHCO3加入到组合的乙酸乙酯层中，然后在振荡器上充分混合15 s，再旋转搅拌15 min。离心后，转移下相0.8 mL，在100℃水浴中加热5 min。加热后，轻摇样品，冷却至室温，用0.2 mL 0.225 mol/L HCl 和1 mL 0.13 mol/L NaHCO3稀释。用50 μL 制备的样品进行分析。

1.4 ELISA 法测定OTA

按照ELISA 试剂盒提供的说明进行。使用ChemWell 2910 分析仪（Awareness Technology，Inc，美国），在450 nm 处测定溶液的吸光度。通过六点校准曲线计算OTA 浓度。

1.5 HPLC-FD 样品制备

5 g 匀浆后的样品，加入1%碳酸氢钠水溶液（7.5 mL），混合5 min。然后加入甲醇（17.5 mL），旋涡离心1 min，均质30 min。将样品离心后（10 min，3 500×g，室温），加入己烷（10 mL）， 摇匀3 min后静置分层，去除上层己烷层，重复提取过程。向样品（5 mL）中加入0.4 mol/L AgNO3溶液（0.25 mL）并再次离心（10 min，3 500×g，室温），通过免疫亲和柱（5 mL，O c h r a p r e p®，R-B i o p h a r m，Glasgow，英国）固相萃取纯化上清液。样品的纯化、洗脱和稀释步骤按照先前描述方法进行（Pleadin等，2013）。

1.6 HPLC-FD 法测定OTA

采用Perši 等人（2014）研究的色谱分析的条件以及HPLC-FD方法。

2 分析方法的验证

两种分析方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）根据从对照组中取10 个特定材料样品的平均值加上3 倍和10 倍标准差计算。通过用标准工作溶液（50 μg/L）添加每种材料的对照样品（每个浓度水平重复三次），在三个不同水平（2.0、5.0和10.0 μg/kg）测定回收率，并根据强化水平用于验证。对于每个基质，回收值表示为在三个强化水平和所有重复中获得的平均值。

3 统计分析

使 用Statistica Ver 6.1 软 件（StatSoft Inc.1984-2003，Tulsa，OK，美国）对猪体重和通过ELISA和HPLC-FD 法测定的OTA 浓度进行统计分析，并通过线性回归确定相关系数（R2）。研究结果为两种分析方法的平均OTA 浓度，统计学显著相关性为95%（P= 0.05）。

4 结果与讨论

本研究中使用分析方法验证结果如表1 所示。ELISA 法测定OTA的LOD 值为0.15 ～1.54 μg/kg，LOQ 值 为0.20 ～2.11 μg/kg。HPLC-FD 测 定OTA 的LOD 和LOQ 范围分别为0.10 ～0.36 μg/kg和0.15 ～0.42 μg/kg。分析两种方法的LOD 和LOQ 值，在尿液中最低，肝脏中最高。ELISA 法回收率为82.3% ～92.4%，HPLC-FD 法回收率为86.3%～ 97.8%，有研究表明生物体液中回收率最高，内脏样品回收率最低。验证结果表明，两种方法均可靠、高效地测定不同生物材料中的OTA 含量。此外，ELISA 法测定的OTA 浓度与HPLCFD 法测定的OTA 浓度在在统计中均具有显著相关性（P＜ 0.05），相关系数较高（R2=0.938 6）。

表1 ELISA 和HPLC-FD 法测定各样品OTA 含量结果

本研究使用饲料中OTA 含量（250 μg OTA/kg）比欧盟委员会建议2006/576/EC（欧盟委员会2006）规定猪饲料最高值（50 μg OTA/kg）高5 倍。因此，本试验动物所饲喂的饲料不符合推荐饲料质量标准；但在克罗地亚地区，250 μg/kg 污染水平已经确定为天然污染结果（Pepeljnjak 等，2008）。

动物体重相关数据分析显示，对照组（92.0±1.55 kg）与试验组（87.6±1.85 kg）的体重有显著差异（P＜0.05）。Krogh 等人（1979）和Malaguti 等人（2005） 研究发现，饲喂OTA 饲料猪只体重会降低。Harvey 等（1994）研究表明，饲料中添加2 500 μg/kg OTA 会抑制动物生长。但Glavitis 和Vanyi（1995）研究提出，在饲料中添加浓度为200 μg/kg OTA 几周后，由于水分滞留动物组织中，导致动物体重增加。

ELISA 和HPLC-FD 方法测定采食OTA 污染的饲粮后猪可食用组织和生物液中的平均OTA 浓度见表2。ELISA 和HPLC-FD 法测定的OTA 水平以及两种方法测定的OTA浓度之间的相关性见图1。

图1 采食OTA 污染饲料后可食用猪组织和生物体液中OTA 含量比较

表2 采食OTA 污染饲粮后猪可食用组织和生物体液中OTA 平均浓度

猪只组织中肾脏中OTA 平均浓度最高，为13.87±1.41 μg/kg。在其他组织中OTA 浓度依次 为： 肺（10.47±1.97 μg/kg）、肝脏（7.28±1.75 μg/kg）、脾脏（4.81±0.99 μg/kg）、 肌肉组织（4.72±0.86 μg/kg）、 脂 肪 组 织（4.11±0.88 μg/kg）、 心 脏（3.71±1.09 μg/kg）和大脑（3.01±0.25 μg/kg）。对照组中OTA 浓度均低于所采用方法的LOD。

与反刍动物相比，猪只对OTA特别敏感，毒素在其肾脏中累积最多，其次是肝脏和肌肉，而猪只脂肪组织中OTA 积累最少（Gareis and Wolff 2000；Lusky 等，1993；Pietri 等，2006）。Rosi 等人（2006）研究采食200 μg/kg OTA 污染饲料后，猪只组织中OTA 含量分布与本研究相同，结果显示猪只肾脏中OTA 浓度最高，为9.6±2.7 μg/kg，其次是肝脏，为6.3±1.7 μg/kg，肌肉组织为1.9±06 μg/kg， 脂肪组织最低为1.1±0.6 μg/kg。Dall'Astra 等人（2010 年）在对猪只进行为期40 d 的OTA 处理（日剂量为0.68 mg，饲喂3.4 kg 添加OTA的商业饲料，以达到200 μg/kg）后，在肌肉组织（股二头肌）中发现了类似OTA 浓度（2.21±0.78 μg/kg）。Lusky 等（1993） 以100 μg/kgOTA 处理饲料饲喂猪只90 d 后，猪只肝脏和肌肉组织中OTA 浓度分别为7.9 μg/kg 和2.7 μg/kg，但其研究结果显示肺部OTA 浓度最高（16.2 μg/kg）。

本研究结果与其他研究结果相 似（Lusky 等，1993；Rosi 等，2006；Dall'Asta 等，2010）。OTA残留分布肾脏和肺部中最多，其次是肝脏、脾脏、肌肉组织、脂肪组织、心脏和大脑。PfohlLeszkowicz 和Manderville（2007 年）声称OTA 在不同组织中的浓度取决于采食OTA时间长短、OTA 剂量和摄入方式。

Lusky 等人（1995）研究显示，在食用天然污染饲料的猪只血清、肝脏、肾脏和肌肉组织中，OTA 的浓度可能比饲喂纯结晶物质OTA的饲料的猪只高3 ～5 倍。在本研究中，采食第28 天（猪屠宰前），血清（4.77±1.57 μg/L） 和尿液（16.06±3.09 μg/L） 中OTA 浓度与对照组相比显著增加。Perši 等人（2012）研究表明，猪只采食28 d OTA 污染饲料后，在第15 天血清中OTA 浓度达到峰值（14.84 μg/L），而在采食第22 天后，OTA 浓度开始下降。可能是因为血液中OTA 含量与最容易累积OTA 组织（肾脏和肝脏）中OTA 含量水平达到平衡（Madsen 等，1982；Gareis and Scheuer，2000）。研究表明，OTA摄入量与其在生物体液中的浓度之间存在相关性。因此，生物体液中的OTA 测定可以作为OTA 监测的快速工具（Pascale and Visconti 2008；Malaguti 等，2005；Perši 等，2012）。

在克罗地亚残留物监测计划和克罗地亚官方控制和监测饲料国家计划的组织下，以及在克罗地亚农业部的主持下，对猪肝中OTA 含量进行监测。然而，法规并未规定最大允许水平，在克罗地亚，也没有规定肉和肉制品中OTA 最高限量。在意大利，肉类和肉制品中OTA 的最大允许限量为1 μg/kg（意大利卫生部，1999 年）。在丹麦，如果动物肾脏和肝脏中检测到OTA 水平在10 ～20 μg/kg 之间，这些组织将被排除不被消费，而如果检测到OTA 水平为25 μg/kg，则整头猪不能生产或销售（CFP/EFSA/FEEDAP/2009/01）。

5 结论

猪只采食被污染饲料后，其所含OTA 含量很可能显著高于允许水平，会导致毒素在检测组织中累积，并存在于生物体液中。检测生物组织中OTA浓度遵循以下顺序：尿液＞肾脏＞肺脏＞肝脏＞脾脏＞血清＞肌肉组织＞脂肪组织＞心脏＞大脑。饲喂受OTA 污染的饲料会导致OTA 在猪只可食用组织中蓄积。因此，本研究为当局在屠宰端对动物胴体中有效的OTA 控制提供指南。这些会被肉类加工厂用作生产肉制品的原材料，因此应特别注意OTA检测。未来研究应该集中在预防措施上，以避免饲料受到OTA 污染，以保护动物和人类健康并防止接触到这种高毒性的霉菌毒素。

（ 原文题目：Comparison of ochratoxin A levels in edible pig tissues and in biological fluids after exposure to a contaminated diet

原 文 作 者：Jelka Pleadin,Nina Kudumija, Dragan Kovačević,Giampiero Scortichini, Salvatore Milone, Ivana Kmeti

原文出处：Mycotoxin Res （2016）32:145-151, DOI 10.1007/s12550-016-0249-7）