清达颗粒通过p38 MAPK通路抑制大鼠高血压心肌肥厚的作用机制研究※

王天一 祁江晗 张珊苑 何晨晨 褚剑锋，2▲

心脏是高血压最常见的靶器官损害之一，长期高血压导致心肌细胞代偿性增殖，间质细胞分泌增多[1-2]，导致心肌肥厚和间质纤维化，最终发生心室重构[3]。因此，降低血压、抑制心肌肥厚的发生发展是防治高血压心肌肥厚的有效途径，是降低其他心血管疾病患病率和死亡率的关键所在。p38丝裂原活化蛋白激 酶（p-38 Mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控细胞增殖与肥大[4]，充当“信息开关”的作用，对心肌肥厚有着非常重要的作用[5]。

清达颗粒由天麻、钩藤、黄芩和莲子心组成，全方共奏平肝潜阳、清泄心火的功效，是陈可冀院士临床经验方，主要用于治疗新发1 级高血压，临床疗效显著。课题组前期研究发现，清达颗粒可以降低多种高血压动物模型的血压，在改善高血压导致的心肌肥厚及心肌纤维化，抑制心室重构等方面疗效显著[6-9]，但具体机制尚未阐明。本实验评估了清达颗粒对自发性高血压大鼠血压、心脏收缩功能和形态学、心脏重量指数、心肌肥厚指标的影响，验证了清达颗粒通过p38 MAPK 通路抑制高血压心肌肥厚的机制，为清达颗粒降低血压、改善心肌肥厚提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物12 只5 w 龄无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat，SHR），6 只同周龄正常血压（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司购入，动物许可证号为SCXK（京）2019-0009。动物饲养于福建中医药大学医学实验动物中心[SYXK（闽）2009-0001]，自由进食、饮水，饲养温度与相对湿度恒定，昼夜交替时间各为12 h。

1.2 药品与试剂清达颗粒由江阴天江药业提供（批号：1704306）；苏木素染色液（批号：G1140）、伊红染色液（批号：G1100）购买于北京索莱宝科技有限公司；异氟烷（批号：970-00026-00）购买于深圳瑞沃德生命科技有限公司；组织总RNA 提取试剂盒（批号：RE-03011）、逆转录试剂盒（批号：RT-01021）、qRTPCR 试剂盒（批号：QP-01011）购买于FOREGENE 公司；ANP 抗体（批号：PA5-79758）、BNP 抗体（批号：PA5-96084）、BCA 蛋白定量分析试剂盒（批号：23227）购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司；pp38 MAPK 抗体（批号：4511S）、p38 MAPK（批号：8690S）、羊抗兔二抗（批号：7074S）购买于美国 CST 公司；GAPDH 抗体（批号：10494-1-AP）购买于美国Proteintech 公司；其他试剂购买于上海碧云天及美国MCE公司。

1.3 仪器Kent Scinetific CODA 八通道无创血压测量仪（美国Kent Scientific公司）；Vero2100超高分辨率小动物彩色超声多普勒成像系统（加拿大Visual Sonics 公司）；生物自动脱水仪及石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机（德国Leica 公司）；Nanodrop One 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；DM4000B显微镜（德国Leica 公司）；ChemiDoc MP Bio-Rad 凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；7500 Real time-PCR 仪（美国 ABI公司）。

1.4 动物分组与给药适应性喂养1 w 后，将自发性高血压大鼠随机分为模型组（SHR 组）和清达颗粒组（SHR+QDG组），每组6只；6只同周龄WKY大鼠作为对照组（WKY 组）。清达颗粒组按照0.9 g/（kg·d）将清达颗粒加入一定比例生理盐水溶解，给予灌胃给药；对照组和模型组给予等体积生理盐水，每日1次，连续8 w。

1.5 无创尾动脉加压法测量血压每周固定同一时间，采用无创尾动脉加压法测量血压，记录每只大鼠清醒状态下尾动脉的收缩压（Systolic blood pressure，SBP）、舒张压（Diastolic blood pressure，DBP）和平均动脉压（Mean arterial pressure，MAP），连续监测8 w。

1.6 超声心动图检测末次给药后，剔除胸部毛发，异氟烷吸入麻醉，采用Vero 2100 成像系统检测大鼠心脏收缩功能变化。将探头置于大鼠胸骨左缘，通过M 型心动图测量关键指标，计算左心室射血分数（left ventricle ejection fractions，LVEF）和左室短轴缩短率（left ventricle fractional shortening，LVFS），取连续3 个周期测量的平均值作为最终结果。

1.7 心脏重量指数计算经腹主动脉取血后取出大鼠心脏，切除心耳，清洗干净后，水平方向横切为三部分，中间部分置于4%多聚甲醛固定液中，心尖部分置于-80 ℃超低温冰箱保存。称量大鼠体重（body weight，BW），测量大鼠胫骨长度（tibial length，TL），计算得出大鼠心脏重量指数（Heart Weight Index，HWI）。计算公式：HWI=BW/TL。

1.8 HE 染色实验48 h 后，将放置于4%的多聚甲醛固定液中的心脏组织，经脱水包埋后，采用全自动石蜡切片机制备4 μm石蜡切片，将切片脱蜡，用于苏木精-伊红（HE）染色，封片后在显微镜下拍摄。

1.9 实时荧光定量聚合酶链反应（quantititive reverse transcription，qRT-PCR）检测心脏组织心房钠尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）、脑利钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）的mRNA 表达提取各组大鼠心脏组织mRNA，逆转录纯化的mRNA，合成cDNA。根据说明书进行qRT-PCR 分析。以GAPDH 为内参，引物序列见表1。采用2-ΔCt相对定量方法进行数据分析：ΔCt(实验组/对照组)=Ct(实验组/对照组目标基因)-Ct(实验组/对照组内参基因)。

表1 mRNA引物序列

1.10 Western Blot 检测心脏组织ANP、BNP、p38 MPAK 以及p-p38 MPAK 蛋白的表达取出-80 ℃保存的心脏组织，每100 mg 加入1 mL Werstern 及IP裂解液（裂解液中含有1×Cocktail、1×Phosstop 和10×PMSF），震荡涡旋、裂解、离心后，取上清液，采用BCA法定量蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶，固定于电泳槽中，恒压90 v，30 min；120 v，1 h 进行电泳。将凝胶放入转膜夹，在转膜槽中恒压110 V转膜。封闭后按照说明书稀释比例分别孵育一抗（ANP、BNP、p38 MPAK、p-p38 MPAK）、羊抗兔二抗后，使用Image Lab凝胶成像系统进行曝光，应用Image J 软件进行定量分析。

1.11 统计学方法采用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理，所有数值均表示为平均值±标准差（±s），两组比较时，首先判断是否符合正态分布，符合时采用t检验；三组比较时，同样先判断是否符合正态分布，符合时采用单因素方差分析。不符合正态分布时，采用非参数检验。P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 清达颗粒对自发性高血压大鼠血压和体重的影响每周血压监测发现，与WKY 组相比，SHR 组SBP、DBP 和MAP 均显著升高（P＜0.05）。给药第3 w开始，与SHR 组相比，SHR+QDG 组SBP、DBP 和MAP均显著降低（P＜0.05）。同时，每周称量体重发现清达颗粒对大鼠体重无明显影响（P＞0.05）。结果表明，清达颗粒降低自发性高血压大鼠血压且对体重无影响。见图1。

图1 清达颗粒对自发性高血压大鼠血压和体重的影响

2.2 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏重量指数的影响计算各组大鼠心脏重量指数，即心脏重量与胫骨长度的比值。与WKY 组相比，SHR 组心脏重量指数显著升高（P＜0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组心脏重量指数显著降低（P＜0.05）。结果表明，清达颗粒可以降低自发性高血压大鼠心脏重量指数。见图2。

图2 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏重量指数的影响

2.3 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏收缩功能的影响灌胃8 w 后，超声心动图显示，与WKY 组相比，SHR组射血分数、短轴缩短率显著降低（P＜0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组可以显著抑制射血分数、短轴缩短率的降低（P＜0.05）。结果表明，清达颗粒可以改善自发性高血压大鼠心脏收缩功能。见图3。

2.4 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织病理变化的影响心脏组织HE染色可发现，WKY组大鼠心肌纤维排列整齐；SHR 组心肌纤维增粗肿胀、排列紊乱，心肌细胞束出现溶解断裂、炎性细胞浸润；SHR+QDG组可显著改善上述病理形态改变。结果表明，清达颗粒可以改善自发性高血压大鼠心脏病理形态的变化。见图4。

2.5 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织ANP、BNP 的mRNA 及蛋白表达的影响经qRT-PCR 和Westren Blot 检测心脏组织ANP、BNP 的表达发现，与WKY 组相比，SHR 组心脏组织ANP、BNP 的mRNA 和蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与SHR 组相比，SHR+QDG组可显著降低ANP、BNP的mRNA和蛋白水平的表达（P＜0.05）。结果表明，清达颗粒可以降低心肌肥厚基因ANP、BNP 的mRNA 和蛋白的表达。见图5-1及图5-2。

图5-1 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织ANP、BNP mRNA的影响

图5-2 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织ANP、BNP 蛋白表达的影响

2.6 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织p38 MAPK 通路相关蛋白表达的影响与WKY 组相比，SHR 组p-p38/p38 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组p-p38/p38蛋白表达显著降低（P＜0.05）。结果表明，清达颗粒可以抑制自发性高血压大鼠心脏p38 MAPK 通路相关蛋白的活化。见图6。

图6 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织p38 MAPK通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

现代医学研究表明，高血压心脏病的特点是以心肌细胞的肥大和间质细胞的增殖为主，不仅使心肌细胞面积增大，而且激活肥厚基因，是心血管事件的独立危险因素[10-12]。心肌肥厚特异性因子ANP是心肌细胞肥厚的反应指标[13]，在SHR心脏组织ANP的mRNA表达较WKY显著升高，并且随高血压的发生、发展而相应增加[14]，同时，胚胎基因BNP 的表达在心肌肥厚过程中也明显增加[15]。本实验发现，清达颗粒可显著降低心脏组织ANP、BNP 的mRNA 和蛋白的表达，改善心脏功能及心脏组织病理变化，提示清达颗粒可以抑制自发性高血压大鼠心肌肥厚。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控细胞增殖与肥大[4]。p38 MAPK作为MAPK家族的主要成员，参与细胞增殖和凋亡、心肌肥厚及能量代谢等[16]，在应激刺激引起的心肌细胞肥大中具有重要作用[17]。一方面，活化的p38 MAPK 激活下游细胞质蛋白和转录因子进而介导肥大信号转导；另一方面，p38 MAPK 的激活直接导致心肌肥厚标志物如ANP、BNP 启动子的活化。Wu 等[18]发现减弱p38 MAPK 的激活可以改善压力超负荷引起的心脏重构和心脏功能；Hui等[19]发现抑制p38 MAPK可显著改善病理性心肌肥厚；血管紧张素Ⅱ干预的大鼠心肌细胞肥厚模型中，抑制p38 MAPK 信号通路可以抑制心肌肥厚标志物的表达水平，改善心肌肥厚[20]。

前期研究发现，清达颗粒对多种高血压动物模型作用显著，既可以降低血压，又可以保护高血压导致的靶器官损害，在改善高血压导致的心肌肥厚及心肌纤维化，抑制心室重构等方面疗效显著[6-9]。多次重复体内实验发现清达颗粒以0.9 g/（kg·d）的给药剂量时，对自发性高血压大鼠的降压效果最为显著[21-22]，因而本次实验选择0.9g/（kg·d）的给药剂量。本实验通过Western Blot 验证了清达颗粒对p38 MAPK 通路相关蛋白活化的影响，结果发现，清达颗粒可以显著降低心脏组织p-p38/p38 的表达，抑制p38 MAPK 通路的活化，初步验证了清达颗粒通过p38 MAPK 通路抑制高血压心肌肥厚的机制。