吡哆醇对鲁氏接合酵母高盐胁迫耐受的影响

陈 胜， 王文欣， 刘子雄， 宋庆怡， 上官玲玲， 姚婉婷， 陈 雄， 代 俊

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068）

酱油作为我国最受欢迎的调味品之一，它是以蛋白质和淀粉为原料，经微生物发酵作用酿造而成的一种产物，具有独特、浑厚、浓郁的风味，已经成为人们生活中不可或缺的调味品之一[1]。 在酱油发酵过程中，酵母这类微生物具有产香、增鲜特性，能使酱油的风味更加良好[2]。 但是高盐稀态法酿造酱油需要在高盐的环境下才能实施，因此研究酵母抗高盐胁迫的能力是提高酱油风味的重要途径之一。鲁氏接合酵母作为典型的耐盐性酵母[3]，可以应用于食品发酵中产生独特的香气与风味物质，但为了更好地适应高盐环境，还需要进一步提高鲁氏接合酵母抗高盐胁迫的能力。

关于鲁氏接合酵母的耐盐机制前人已有探索，发现其耐盐性主要与细胞壁和细胞膜组成成分和形态、Na+转运系统、细胞内生物相容性物质以及抗氧化还原能力有关[4]。 为了增加发酵食品的风味，进一步深入研究鲁氏接合酵母的耐盐机制是至关重要的。

前人通过外源添加物质来改变鲁氏接合酵母的代谢性质， 比如添加D-果糖来改变呋喃酮代谢机制[5]，因此作者通过添加外源物质来提高鲁氏接合酵母对高盐环境的适应性。 已有文献报道，维生素B6（vitamin B6，VB6）能够调节酵母细胞信号传导，调节细胞膜上离子通道，增强细胞抗胁迫能力等[6]。VB6作为一种营养丰富的物质， 添加后能提供发酵菌株更好的生长[7]；而且，VB6还能提高细胞活性，提高发酵菌株的抗逆性。 VB6是由吡哆醇（PN）、吡哆醛（PL）、吡哆胺（PM）及其磷酸化衍生物在细胞内相互转化形成的[8]，并且磷酸吡哆醛（PLP）是由PN、PL 或PM 形成的最主要的活性形式， 还能在氨基酸代谢过程中行使辅酶的作用[9]；吡哆醇的生物合成也与硫胺素相互联系[8]。 近年来，植物中已证明维生素B6可作为活性氧自由基（ROS）清除剂，具有增加对生物和非生物胁迫抗性因子的附加功能[10]。由此考虑吡哆醇作为提高鲁氏接合酵母耐盐性营养物质的可能性。

目前，国内外已有报道阐明了维生素对动植物的影响，不仅可以增强植物抗氧化能力，并且还可对动物的免疫功能产生影响[11-12]，但外源添加维生素对鲁氏接合酵母耐盐性影响的探究还比较少，因此本研究中主要是基于前期调研基础上，通过在高盐胁迫条件下，研究外源添加吡哆醇对菌株的生长状况、 产甘油和海藻糖等生物相容性物质的能力、转运Na+的能力等生理代谢过程的影响， 进一步提高鲁氏接合酵母在增强发酵食品比如酱油风味品质的应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株

鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii ）A 菌株： 中国典型培养物保藏中心提供， 保藏号为CCTCCM 2013310[13]，由作者所在实验室分离保藏。

1.2 材料与仪器

YEPD 培养基： 20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L 酵母浸粉。 固体培养基则另加入20 g/L 琼脂。 根据盐质量浓度的不同分别加入18 g/dL NaCl或者14 g/dL NaCl，115 ℃灭菌20 min。

酵母浸粉：安琪酵母公司产品；葡萄糖、NaCl、无水乙醇、3，5-二硝基水杨酸：国药集团产品；蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂产品；吡哆醇、三氯乙酸：上海麦克林公司产品；甘油含量测定试剂盒：北京普利莱公司产品；腺苷三磷酸酶试剂盒：南京建成生物工程研究所产品。

UV-722 型紫外可见光分光光度计： 上海精密科学仪器公司产品；YXQ-LS-100SⅡ型高压蒸汽灭菌锅、SPX-150D 型恒温生化培养箱：上海博讯实业公司产品；5810R 型高速冷冻离心机： 德国Eppendorf 公司产品；SBA-90 型生物分析传感仪：山东省科学院生物研究所提供；Synergy H1 全功能酶标仪：美国伯腾仪器公司产品；ZA3300 型原子吸收光谱仪： 日本HITACHI 公司产品；7890B 型气相色谱仪、Ultimate 3000 型高效液相色谱仪： 赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化及培养条件 首先将鲁氏接合酵母菌种活化于YEPD 培养基，间隔24 h 后再次活化得到次级种子液，然后取次级种子液按照体积分数5%的接种量分别接种于含有2 g/L 吡哆醇、18 g/dL NaCl 的YEPD 培养基（实验组）和不添加吡哆醇的YEPD 培养基中（对照组），最后在30 ℃、200 r/min条件下发酵培养并取各个生长阶段的样品测定各项生理生化特征数据。

1.3.2 吡哆醇质量浓度的确定 为了更明显地看出不同质量浓度吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母生长的影响，避免在含18 g/dL NaCl 的YEPD 平板上生长区分度不高，因此降低盐质量浓度，采用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 平板进行后续实验。 先将次级种子液稀释到OD600nm为1, 然后按照10、100、1 000 倍梯度稀释， 之后取0.8 μL 点样于添加6 种梯度质量浓度吡哆醇（0～2 g/L） 的含14 g/dL NaCl的YEPD 固体培养基上，最后30 ℃恒温培养60 h，观察菌落的生长状况。

1.3.3 生物量的测定 取5 mL 摇瓶发酵液，5 000 r/min 离心10 min，去上清液，加5 mL 去离子水重悬酵母细胞，相同条件离心水洗3 次，最后用5 mL去离子水重悬细胞，稀释后以去离子水为对照在紫外可见光分光光度计600 nm 处进行比色测定，光密度OD600nm为OD 读数与稀释倍数的乘积。

1.3.4 细胞干质量的测定 分别用电子天平称量干燥的离心管质量以及5 mL 摇瓶发酵液经过离心洗涤烘干至质量恒定的离心管和菌体的总质量，利用两者之差计算出每毫升发酵液的细胞干质量。

1.3.5 葡萄糖质量浓度的测定 取2 mL 摇瓶发酵液，12 000 r/min 离心5 min， 取上清液采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS）测定发酵液中葡萄糖的质量浓度[14]。

1.3.6 乙醇产量的测定 取2 mL 摇瓶发酵液，12 000 r/min 离心5 min， 取上清液使用SBA-90 型生物分析传感仪测量[15]。

1.3.7 甘油含量的测定 使用甘油含量测定试剂盒测定细胞内外甘油的含量。

1.3.8 细胞内海藻糖质量分数的测定 取5 mL 摇瓶发酵液，5 000 r/min 离心10 min，去上清液，用冰水清洗3 次后收集菌体。 在菌体中加入4 mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸，振荡均匀后置于冰水混合物中，每15min 振荡一次，1 h 后于3 000 r/min 离心5 min，吸取1 mL 上清液于试管中， 加入5 mL 硫酸蒽酮，沸水浴10 min，冷却后于630 nm 处测定OD 值。 再制作海藻糖标准曲线，将样品测得的OD630nm值根据标准曲线计算出海藻糖质量分数，以细胞干质量计[16]。

1.3.9 细胞内钠钾比率（Na+/K+）的测定 使用原子吸收光谱仪测定细胞内的钠和钾离子的质量浓度[13]。

1.3.10 Na+/K+-ATP 酶活性的测定 采用腺苷三磷酸酶试剂盒测定，结果以蛋白质质量计[13]。

1.3.11 2-苯乙醇产量的测定 取1 mL 摇瓶发酵液，5 000 r/min 离心10 min， 收集上清液， 用0.22 μm 有机系滤膜过滤，采用高效液相色谱法测定2-苯乙醇的产量。 检测条件为Venusil MP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，进样量为10 μL，流动相中甲醇与水体积比为6∶4，流量为0.6 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为210 nm，检测时间为20 min[17]。

1.3.12 统计分析 采用Origin 9.0、GraphPad Prism 5等软件对数据进行处理并绘图，显著性水平设置为1%。 实验均重复3 次，图表中数据结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 促进鲁氏接合酵母生长的最佳吡哆醇质量浓度的确定

吡哆醇主要是通过进入细胞内转化成磷酸吡哆醛（PLP）的活性形式来作为相关反应酶的辅酶或者底物，从而参与各种合成代谢反应。 鲁氏接合酵母可以耐受18 g/dL 的NaCl，但基于前期基础，为了使酵母生长实验结果对比更加明确，本实验中选用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 固体培养基来探究添加不同质量浓度的吡哆醇对鲁氏接合酵母生长的影响，结果如图1 所示。 结果表明，鲁氏接合酵母在不同质量浓度吡哆醇的影响下， 外源添加2 g/L 吡哆醇时的生长状况最好，而其他质量浓度对鲁氏接合酵母的促生长作用并不明显。没有做更高质量浓度下吡哆醇的促生长作用是因为2 g/L 的质量浓度相对较高，再提高质量浓度已经不再适合工业上扩大生产。 所以最终选取外源添加2 g/L 的吡哆醇来探究其对鲁氏接合酵母抗高盐胁迫机制的影响。

图1 不同质量浓度吡哆醇对鲁氏接合酵母生长的影响Fig. 1 Effect of pyridoxine with different concentrations on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

2.2 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞生长和葡萄糖消耗的影响

鲁氏接合酵母在生长过程中伴随着糖类物质的消耗，从而提供能量供自己生长以及产生其他物质如乙醇、甘油等来应对外界胁迫的压力。 探究在含18 g/dL NaCl 的YEPD 液体培养基中添加吡哆醇对鲁氏接合酵母细胞生长和葡萄糖消耗的影响，结果如图2 所示。 在对照组中，鲁氏接合酵母经历了36 h 的延滞期后才进入对数期快速生长，葡萄糖也是刚好在36 h 被快速消耗。 与对照组相比，实验组消耗葡萄糖的速度更快，进入对数期的时间也提前了24 h，相当于缩短了2/3 的延滞期，并且从图中可以判断出在72 h 后两者进入稳定期，此时对照组与实验组的OD600nm值分别为9.4、10.4，生物量提高了10.6%， 表明吡哆醇的添加不仅可以缩短延滞期的时间，还可以促进鲁氏接合酵母的生物量积累。

图2 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞生长和葡萄糖消耗的影响Fig. 2 Effect of pyridoxine on cell growth and glucose consumption of Zygosaccharomyces rouxii

在12 h 内， 实验组的葡萄糖质量浓度降低了8%，但OD600nm值总体变化很小，这种现象表明添加吡哆醇能够促进鲁氏接合酵母对葡萄糖的利用，生物量变化很小，进一步说明对葡萄糖的利用更可能用于合成维持细胞渗透压稳定的物质来抵抗外界的胁迫。 细胞内主要是甘油和海藻糖等物质，合成的这些物质可以提高鲁氏接合酵母在高盐胁迫下的耐受性。 但这只是初步推测，吡哆醇的添加能否加快葡萄糖的代谢来用于合成甘油以及海藻糖等物质还需下一步实验来判断。而在12 h 之后随着葡萄糖的不断消耗，生物量快速增加，这种现象表明，添加吡哆醇能加快生物代谢，促进葡萄糖的吸收利用。 磷酸吡哆醛是吡哆醇的活性形式，在140 多种不同的酶反应中行使辅因子功能，在酵母的生长代谢中发挥重要作用[18]。因此，在高盐胁迫下添加吡哆醇能够加快氨基酸代谢刺激酵母的生长，合成相关物质维持细胞的渗透压平衡。

2.3 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母乙醇产量的影响

乙醇作为来源广泛、清洁、可再生的燃料，有利于发展绿色循环经济。 在酱油生产过程中，乙醇有利于酱油的保存[19]，提高乙醇产量可提高酱油的质量。 添加吡哆醇对鲁氏接合酵母乙醇产量的影响如图3 所示。 结果表明，添加吡哆醇的实验组在刚进入对数期后乙醇产量大幅度提高，随着葡萄糖的消耗， 乙醇产量从12 h 的0.15 g/L 涨到最大值30 h的4.20 g/L，当葡萄糖几乎消耗完时，乙醇产量才逐渐下降。 与对照组相比（对照组乙醇产量最大达到4.00 g/L），乙醇产量增加了5%。

图3 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母乙醇产量的影响Fig. 3 Effect of pyridoxine on the ethanol production of Zygosaccharomyces rouxii

上述实验结果表明外源添加吡哆醇可以提高鲁氏接合酵母的乙醇产量，这可能是因为氨基酸代谢形成的碳骨架有利于糖的合成，为糖酵解途径产生乙醇提供了可能[20]。 而且芳香族氨基酸代谢有利于提高菌株对乙醇的耐受性从而增加乙醇的产量[21]。外源添加吡哆醇还可以促进硫胺素的合成[8]， 硫胺素焦磷酸能作为辅助因子促进丙酮酸脱羧形成乙醛，乙醛进一步还原成乙醇，进而提高乙醇的产量[13]。

2.4 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母甘油含量和细胞内海藻糖质量分数的影响

甘油和海藻糖作为重要的生物相容性物质，在鲁氏接合酵母受到高盐胁迫时会发挥关键的作用。比如拥有较好亲水性能的多羟基的甘油，能够维持细胞内的水分活度，平衡细胞内外的渗透压，并且高渗甘油(high osmolarity glycerol, HOG)应答途径是真核细胞应答高渗透压胁迫的关键响应机制[22]，能让细胞在高盐条件下避免脱水死亡。 海藻糖是一种典型的应激代谢产物，由于其特殊的物理性质和稳定的化学结构，在酵母细胞面临高渗透压等恶劣环境时形成一层保护膜，能有效地保护酵母细胞结构不被破坏；此外海藻糖的水解还可为蛋白质恢复活性提供能量，从而维持酵母细胞在胁迫条件下的生存[23]。 因此，甘油和海藻糖的含量变化关系着酵母细胞抗逆性的强弱。 探究在高盐胁迫下吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内外甘油含量的影响，结果如图4 所示。 由图4（a）可知，对照组在前48 h 内，细胞内甘油随着葡萄糖的消耗而稳定地合成，在48 h 时达到最大积累量（48.81 mg/g，以细胞干质量计），此时鲁氏接合酵母刚好进入对数期中期，细胞快速生长，之后细胞内甘油代替葡萄糖作为碳源快速消耗，以维持细胞继续生长。 在实验组中，添加吡哆醇后，鲁氏接合酵母细胞内甘油在24 h 时达到最大积累量（45.46 mg/g），随后也如对照组一般快速消耗，但两组每克干细胞所积累甘油的最大值并无明显差别（P＞0.05）。 这说明在吡哆醇的外源添加影响下，鲁氏接合酵母能在高盐高渗环境中提前激活HOG 应答途径，从而提前合成和积累甘油，为延滞期细胞提供更多地保护， 平衡细胞内的渗透压，以尽快适应高盐高渗环境。

图4 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内外甘油含量的影响Fig. 4 Effect of pyridoxine on the intracellular and extracellular glycerol content of Zygosaccharomyces rouxii

吡哆醇的添加对细胞外甘油的影响如图4（b）所示。 实验组在前30 h 内细胞外甘油不断积累，且在30 h 达到最大值13.95 mmol/L， 随后快速消耗。而对照组细胞外甘油在前54 h 内积累， 在54 h 达到最大值18.05 mmol/L，比实验组高出29%。这表明在细胞刚开始生长时， 葡萄糖作为主要碳源被消耗，从而细胞外甘油开始积累，而在葡萄糖消耗完后，细胞外甘油可以被吸收到细胞内作为迟效碳源继续供细胞生长。 在高盐高渗条件下，外源添加吡哆醇后，鲁氏接合酵母细胞能够促进细胞外甘油进入细胞，从而达到更多的生物量，并且还可以更好地平衡渗透压， 使细胞在高盐高渗条件下生存下去，提高酵母耐盐性。

吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内海藻糖质量分数的影响如图5 所示。 实验组和对照组细胞内海藻糖都在前12 h 快速消耗，并且在前48 h 内，实验组的海藻糖比对照组的海藻糖消耗的更多，分解速率更快，由此可知外源添加吡哆醇后，细胞内海藻糖消耗加快，为细胞代谢提供碳源，这是因为吡哆醇会参与氨基酸的各种反应，促进酵母细胞的生长代谢，从而加速海藻糖的吸收利用。

图5 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内海藻糖质量分数的影响Fig. 5 Effect of pyridoxine on the intracellular trehalose content of Zygosaccharomyces rouxii

高盐胁迫条件下，酵母会产生一些生物相容性物质来平衡渗透压，以防止细胞失水死亡或维持细胞内各种稳态。 甘油和海藻糖作为经典的渗透调节物质，从实验结果来看，鲁氏接合酵母更依赖于甘油的富集来对抗高盐的胁迫， 而并非海藻糖的积累。 在高盐胁迫条件下，添加吡哆醇后，鲁氏接合酵母细胞内甘油合成明显提前， 细胞外甘油外排减少，从而提高细胞在高盐条件下的适应性。 而对于海藻糖而言，添加吡哆醇后，消耗反而增加，这表明外源添加的吡哆醇会促进海藻糖作为碳源被消耗，而非将其作为保护性物质，但其加速消耗也为酵母生长提供了有利条件。 上述结果表明，鲁氏接合酵母在高盐胁迫条件下主要是利用甘油的生物相容性来增强其抗胁迫的能力， 而外源添加吡哆醇后，有利于甘油提前合成， 更早去抵抗高盐胁迫的环境，同时也加快了海藻糖的利用，提高生物量，使细胞能更快适应高盐高渗环境。

2.5 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影响

Na+/K+-ATP 酶作为分布在细胞膜上的膜结合蛋白酶，主要功能是排出过量钠离子，解除钠离子对细胞的毒性，维持钾离子稳态和细胞内pH 稳定，平衡细胞内外渗透压与维持细胞膜完整性，其酶活性大小关系着细胞抗高盐胁迫能力的强弱[24]。 鲁氏接合酵母在高盐胁迫条件下， 细胞内Na+含量远大于K+， 此时为了避免Na+的毒性， 就需要Na+/K+-ATP 酶依赖于ATP 的能量将Na+从细胞内转运到细胞外，将K+转运到细胞内，平衡细胞内外离子差以及渗透压。 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影响如图6 所示。 结果表明，整个生长时期，对照组细胞内Na+/K+一直持续下降， 而实验组Na+/K+是对数期先下降， 稳定期Na+/K+些许上升，原因可能为在高盐胁迫下，细胞会产生一些活性氧自由基（ROS）[25],而这些活性氧自由基会对细胞膜造成损伤，从而影响Na+/K+-ATP 酶活性，导致Na+/K+上升。 在延滞期时，实验组的Na+/K+比对照组低26.5%（P＜0.05）；而在对数期，实验组的Na+/K+比对照组低82.3%（P＜0.05）。从延滞期到对数期，添加吡哆醇后，实验组的Na+/K+下降的幅度远高于对照组，表明在高盐胁迫条件下，吡哆醇增强了细胞膜上离子通道的调节作用，有利于Na+的外排。由图6（b）可知，在对数期，实验组Na+/K+-ATP 酶活性比对照组高16.9%； 在稳定期， 实验组Na+/K+-ATP 酶活性比对照组高35.2%。 而无论是对数期还是稳定期，实验组的Na+/K+-ATP 酶活性都比对照组的高，这一点证明了在高盐胁迫下，外源添加吡哆醇能够促进Na+/K+-ATP 酶活性，调节细胞内外离子平衡以及渗透平衡， 降低Na+对酵母细胞的毒害作用从而增加细胞活性。

图6 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母细胞内Na+/K+及细胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性的影响Fig. 6 Effect of pyridoxine on the ratio of Na+/K+ in the cell and the activity of Na+/K+-ATPase on the cell membrane of Zygosaccharomyces rouxii

2.6 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母2-苯乙醇产量的影响

2-苯乙醇作为效用普遍、价值可观的高级芳香醇，其特有的玫瑰香气对酱油风味的形成起重要作用。 酱油发酵中若是缺少这种香味物质，则其风味就会淡薄[26]。 因此提高2-苯乙醇的产量不仅有利于增加发酵食品的风味，使其更受欢迎，并且也为生产2-苯乙醇提供一定的参考。吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母2-苯乙醇产量的影响如图7 所示。结果表明，实验组在对数期鲁氏接合酵母的2-苯乙醇产量为11.50 mg/L，比对照组的2-苯乙醇产量（1.55 mg/L）提高了6.42 倍；在稳定期，对照组的2-苯乙醇产量为13.13 mg/L，实验组为29.64 mg/L，相比于对照组提高了1.26 倍。这表明，在高盐胁迫条件下，外源添加的吡哆醇可以通过在氨基酸代谢中行使辅酶功能（包括转氨作用、脱羧作用等[18]）提高鲁氏接合酵母2-苯乙醇的产量。这是因为酵母产生2-苯乙醇涉及氨基酸的转运与调控，而吡哆醇在其氨基酸代谢中起着重要作用， 因此才促进产量增加高达6.42 倍。上述结果表明， 鲁氏接合酵母在高盐胁迫条件下，外源添加行使辅酶功能的吡哆醇能够促进2-苯乙醇产量的提高。

图7 吡哆醇的添加对鲁氏接合酵母的2-苯乙醇产量影响Fig. 7 Effect of pyridoxine on the production of 2-phenylethanol of Zygosaccharomyces rouxii

3 结 语

研究结果表明，在高盐胁迫条件下，添加吡哆醇（2 g/L）提高了鲁氏接合酵母细胞对高盐胁迫的耐受性， 缩短了高盐胁迫条件下酵母生长的延滞期，提高了生物量，有利于食品发酵中香味物质的提前形成以及风味增加； 还促进了甘油的提前合成，使细胞提前适应高盐环境，以及提高了细胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性，降低Na+的毒害作用从而提高细胞活性。 除此之外，吡哆醇的添加还提高了乙醇和2-苯乙醇的产量，对酱油的保存和增香有很大的促进作用，最终提高了酱油的风味。

由此可见，吡哆醇的添加能提高鲁氏接合酵母对高盐胁迫的耐受能力，提高在高盐胁迫条件下的生物量，增加发酵过程中风味物质的含量，实验结果给工业上提高酱油等发酵食品风味提供了一定的思路和参考，以及有助于探索耐盐产香酵母风味形成的机理。 作者初步探索了吡哆醇这类维生素对鲁氏接合酵母高盐胁迫耐受的影响，更深的分子机理以及其他类物质对其是否有同类作用还需进一步探究。