遮阴对柠檬香茅类黄酮及其合成酶基因差异表达研究

张少平, 鞠玉栋, 李洲, 练冬梅, 吴松海, 赖正锋, 洪建基

遮阴对柠檬香茅类黄酮及其合成酶基因差异表达研究

张少平, 鞠玉栋*, 李洲, 练冬梅, 吴松海, 赖正锋, 洪建基

(福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建 漳州 363005)

为了解柠檬香茅()中类黄酮及其合成酶基因信息，以阳光直射及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶为材料，进行代谢组、转录组结合qRT-PCR验证分析。结果表明，柠檬香茅中含有11类共69种黄酮化合物，其中芦丁、去甲基托罗沙黄酮、紫云英苷及葡萄糖醇等类黄酮化合物在遮阴环境下相对含量显著降低；类黄酮生物合成涉及10类酶54个基因，其中类黄酮3′羟化酶(c99177.1)等4个酶基因在遮阴环境下相对表达量显著降低，而异黄酮合成酶(c51975.0)等6个酶基因相对表达量正好相反；其中5个类黄酮合成酶基因在光照及遮阴柠檬香茅中的上下调表达趋势与转录组测序结果中FPKM值变化一致，而二者检测结果中差异表达倍数存在差异。遮阴使柠檬香茅中大多黄酮类化合物相对含量降低，而其合成酶基因上下调表达趋势规律不明显。

柠檬香茅；类黄酮；代谢产物；合成酶；代谢组；转录组

柠檬香茅()为禾本科(Poaceae)香茅属多年生具香味草本植物，广泛种植于非洲东部及西印度群岛等热带地区，中国福建、台湾、广东、广西及海南有栽培[1]。柠檬香茅具有特殊柠檬香气，传统常用来烹饪调味、提取香茅精油及园林造景等[2–3]。近年来，由于柠檬香茅含有类黄酮等天然抗菌物质，在饲料防腐、改善禽畜品质、抑菌防病、调节机体功能及提高免疫力等起重要作用, 因此，使用柠檬香茅作为抗生素饲料添加剂，在畜禽养殖业中展示了很好的应用前景[4–6]。类黄酮也叫黄酮类化合物，其母核为2-苯基色原酮的一类重要的多酚类次生代谢产物，具有C6-C3-C6的基本化学结构[7]，其所含的多个酚羟基可清除自由基及抗机体氧化，是其具有多种生理功能的基本生物学基础[8]。类黄酮根据C环部分的成环、氧化、取代等方式差异，可分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、查尔酮、花青素、橙酮类等以及上述各类的二氢衍生物[9–10]。类黄酮广泛存在于从苔藓到种子等各种植物体内，参与到植物对生物和非生物胁迫的响应中，并对植物抵抗逆境胁迫起到重要作用[11–12]。类黄酮对人体具有强大的生物活性，如抗菌消炎、抗氧化延缓衰老、清热解毒、抗癌防癌、治疗心脑血管疾病及保持健康方面等多种功效[13–15]。类黄酮合成途径大致分为前期和后期两个阶段[16]，前期合成包括了查尔酮合酶()、查尔酮异构酶()和黄烷酮3-羟化酶()，它们是参与所有下游类黄酮生物合成途径的共有基因[17]。类黄酮合成途径中原花青素和花青素的后期合成基因则包括了类黄酮3′-羟化酶()、类黄酮3′5′-羟化酶()、二氢黄酮醇还原酶()、花青素合酶()和类黄酮-3--葡糖基转移酶()[18]；无色花青素还原酶()和花青素还原酶()分别催化无色花青素形成黄烷-3-醇(如儿茶素)和催化花青素形成表-黄烷-3-醇(如表儿茶素)[19]；此外，黄酮合酶()控制着黄烷酮向黄酮的转化，而黄酮醇合酶()则将二氢黄酮醇催化为黄酮醇[20]。

香茅的研究主要集中在精油(挥发性单萜)的提取及应用等方面[21–23]。目前，并未见香茅类黄酮相关研究报道，而植物类黄酮成分鉴定、功效评价以及类黄酮代谢过程中相关基因的遗传调控等一直为研究热点[24–26]。然而，随着香茅种植面积扩大及所需土地利用率的提高，香茅种植常出现间作及套种等栽培模式，因此香茅常在光线不够充足环境下种植生长。本研究以光照和遮阴下的柠檬香茅为材料，通过代谢组检测结合转录组测序，分析柠檬香茅类黄酮差异成分及合成代谢相关差异表达酶基因信息，为进一步完善香茅种植模式及进行香茅类黄酮具体成分功效评价、生物合成相关基因工程等研究打下良好基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为福建漳州当地种植的柠檬香茅()，初夏分株繁殖种植于试验盆中，其中3盆放置大田阳光照射充足处，另3盆放置大田覆盖遮光率为60%的遮阳网。分株种植3个月后，取光照及遮阴环境下生长的两组柠檬香茅嫩叶各6份，每组3份嫩叶进行代谢组学比较分析, 另3份进行转录组学比较分析，同时在进行转录组研究的光照及遮阴两组柠檬香茅嫩叶中，各取1份进行目的基因qRT-PCR验证，3次重复。

1.2 代谢组学测定及类黄酮成分筛选

分别取光照及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶，各3次重复共6份材料。每份样品依次通过冷冻干燥机(Scientz-100 F)干燥，研磨仪(MM 400, Retsch)研磨，甲醇提取液提取，取上清及微孔滤膜过滤, 滤液存放进样瓶中进行超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析[27]。基于百迈客公司所建的采用化学标品结合同公共库的二级谱图进行比对建立的数据库MWDB (metware database), 通过二级谱信息进行柠檬香茅代谢物的定性定量, 进一步进行类黄酮代谢物的筛选，相对含量取平均值。

1.3 转录组学测定及类黄酮合成酶筛选

分别取光照及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶，各3次重复共6份材料。每份样品依次进行RNA提取，等量混合组成RNA池，磁珠富集mRNA, 逆转录成cDNA，连接测序接头，制备测序文库，PCR富集测序样本，Illumina HiSeq 2500测序平台测序及数据分析[28]。进一步进行类黄酮合成代谢相关酶基因筛选，相关合成酶基因相对表达量取3次重复的平均值。

1.4 差异基因qRT-PCR分析

从用于转录组测序的柠檬香茅嫩叶中，挑选光照(标号：阳1-1)和遮阴(标号：阴1-1)各1个样本的总RNA进行OD值测定，质量合格的柠檬香茅总RNA采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)进行反转录，根据反转录试剂盒说明书中的反应体系及条件，合成两种环境下生长的柠檬香茅嫩叶cDNA，以其为模板，进行其中5个类黄酮合成酶基因的qRT-PCR检测(相关合成酶基因及其引物序列见表1)，每个合成酶基因检测3次，结果取平均值。

表1 荧光定量PCR分析的5个基因及所合成的引物

2 结果和分析

2.1 代谢组检测类黄酮化合物

代谢组分析光照及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶，进一步进行类黄酮具体成分及其相对含量比较分析。结果表明，柠檬香茅所含类黄酮化合物共69种(表2)，具体包括黄酮化合物24种、黄酮醇13种、黄烷酮7种、黄烷醇2种、异黄酮10种、查尔酮7种、花青素2种以及紫檀素、原花青素、黄酮聚合物和橙酮类各1种。绝大多数类黄酮化合物在光照环境下相对含量偏高，尤其黄酮中芦丁、去甲基托罗沙黄酮、荭草素阿拉伯呋喃糖苷和鼠李糖基人参素，黄酮醇中紫云英苷，异黄酮中葡萄糖醇等代谢物在光照环境下相对含量显著提高。然而黄酮中芹菜素鼠李糖苷，黄酮醇中淫羊藿属苷C和槲皮素二甲醚异戊酸，异黄酮中刺芒柄花素昆布苷和刺芒柄花苷等少量代谢物在光照环境下相对含量更低。

2.2 转录组测序所获类黄酮合成酶基因信息

转录组学分析光照及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶，进一步进行类黄酮合成酶基因及其相对表达量比较分析。结果表明，柠檬香茅所含类黄酮生物合成中编码10类酶的54个家族基因(表3)，具体包括9个、5个、6个、12个、2个、4个、1个、4个、7个和4个。光照和遮阴环境下的类黄酮合成酶基因相对表达量极低且差异表达不明显，只有(c99177.1、c102417.0)、(c98575.0)、(c99741.0)等4个基因在光照环境下相对表达量更高;而(c103029.3)、(c97610.0)、(c64180.0)、(c51975.0)、(c99356.0、c102638.1)等6个基因在遮阴环境下相对表达量更高。

2.3 差异表达基因qRT-PCR检测

根据转录组测序结果，选择光照和遮阴环境下生长的柠檬香茅中FPKM值差异明显的5个类黄酮合成酶相关基因(表4)进行qRT-PCR检测，结果表明，该5个参与类黄酮合成酶基因中的3个下调、2个上调与转录组中FPKM值变化一致(图1)，而二者检测结果中的差异表达倍数存在一定差异。

3 结论和讨论

香茅研究主要集中在精油提取、功效评价及利用等，目前并未见香茅类黄酮相关成分研究报道, 而植物类黄酮成分鉴定、功效评价以及类黄酮代谢过程中相关基因资源克隆及转基因利用等一直为研究热点[29–31]。同时，随着香茅种植面积扩大及所需土地利用率的提高，香茅种植出现间作及套种等栽培模式，因此香茅常在光线不够充足环境下生长。本研究以光照和遮阴两组柠檬香茅为材料进行代谢组检测结合转录组测序，代谢组学研究获得柠檬香茅中11类共69种类黄酮化合物，绝大多数类黄酮化合物在光照环境下相对含量偏高，尤其黄酮中荭草素阿拉伯呋喃糖苷、鼠李糖基人参素和芦丁, 黄酮醇中紫云英苷，异黄酮中葡萄糖醇等代谢物在光照环境下相对含量显著提高。光线不足会影响柠檬香茅生长期的生物产量[1]，本研究表明，遮阴极大地降低柠檬香茅类黄酮的整体含量，这与前人[32]报道提高光照强度能显著提高植物类黄酮含量相吻合。本研究表明黄酮中芹菜素鼠李糖苷，黄酮醇中淫羊藿属苷和槲皮素二甲醚异戊酸, 异黄酮中刺芒柄花素昆布苷和刺芒柄花苷等少量类黄酮代谢物在光照环境下相对含量更低。

同行数据后不同字母表示差异显著(<0.05)。下同

Data followed different letters in the same line indicate significant differences at 0.05 level. The same below

表4 荧光定量PCR分析柠檬香茅中5个差异表达基因

图1 5个差异表达基因的qRT-PCR验证。*: P<0.05

转录组研究柠檬香茅所含类黄酮生物合成中编码10类酶的54个基因中，、、等4个基因在光照环境下相对表达量更高；而、、等6个基因在遮阴环境下相对表达量更高。虽然柠檬香茅中存在大量类黄酮合成相关家族酶基因，但在光照和遮阴环境下差异表达明显的只有少数，这少数差异表达的类黄酮合成酶基因与类黄酮总体含量趋势相关性不明显，这主要是因为类黄酮化合物种类繁多，其生物合成路线复杂，不同合成酶基因只与其中某类(或某几类)黄酮化合物关联性密切[14]，如、、、、和等催化花青素及黄酮醇和原花青素的合成,这些酶基因中的和催化二氢黄酮醇转换成不稳定的花色素，然后催化这些不稳定的花色素发生糖基化反应，形成有色的相对比较稳定的花色素苷；原花青素的合成从无色花青素和花色素经过或催化形成儿茶素或表儿茶素；多酚氧化酶催化无色花青素分子加入到儿茶素或表儿茶素形成原花青素多聚体；原花青素和花青素的合成过程中使用共同的底物，因此这些平行途径之间存在的竞争可能是决定花青素或原花青素合成的重要调控机制。此外，类黄酮合成受内部因素相关合成酶基因影响外，还与其转录因子如、和等密切相关，同时类黄酮合成还与外部因素如光照、温度、水分及营养物质等外部因素有关，因此，在遮阴和光照环境下，柠檬香茅中少数差异表达的类黄酮合成酶基因与类黄酮总体含量趋势相关性不明显。

综上，柠檬香茅富含类黄酮化合物，其合成酶基因种类繁多且含有大量家族基因。遮阴不仅会抑制柠檬香茅的营养生长，而且同时降低了柠檬香茅中大多数类黄酮化合物的相对含量，但类黄酮合成代谢相关酶基因上下调表达趋势规律不明显。

[1] QIU S L. Citronella Resources and Their Utilization [M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2019: 1–172. [邱珊莲. 香茅资源及其利用 [M]. 北京: 中国农业科学技术出版社, 2019: 1–172.]

[2] HACKE A C M, MIYOSHI E, MARQUES J A, et al. Anxiolytic properties of(DC.) stapf extract, essential oil and its constituents in zebrafish () [J]. J Ethnopharmacol, 2020, 260: 113036. doi: 10.1016/j.jep.2020.113036.

[3] BAYALA B, BASSOLE I H N, MAQDASY S, et al.andessential oils have cytotoxic effects on tumor cell cultures: Identification of citral as a new putative anti-proliferative molecule [J]. Biochimie, 2018, 153: 162–170. doi: 10.1016/j.biochi.2018.02.013.

[4] SHAH G, SHRI R, PANCHAL V, et al. Scientific basis for the thera- peutic use of, stapf (Lemon grass) [J]. J Adv Pharm Technol Res, 2011, 2(1): 3–8. doi: 10.4103/2231-4040.79796.

[5] DA ROCHA L O, DA SILVA LEMOS G C, VIEIRA I J C, et al. Chemical characterization andbiological activity ofextracts againstspp. andspp. nematodes from sheep [J]. Parasitology, 2020, 147(13): 1559– 1568. doi: 10.1017/S0031182020001432.

[6] DA SILVA L C, DE SOUZA PERINOTTO W, SÁ F A, et al.acaricidal activity of,andagainst(Acari: Ixodidae) [J]. Exp Parasitol, 2020, 216: 107937. doi: 10.1016/j.exppara.2020. 107937.

[7] AYABE S I, AKASHI T. Cytochrome P450s in flavonoid metabolism [J]. Phytochem Rev, 2006, 5(2): 271–282. doi: 10.1007/s11101-006- 9007-3.

[8] JI Y, LI B Z, QIAO M, et al. Advances on theandglycosylations of flavonoids [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2020, 104(15): 6587–6600. doi: 10.1007/s00253-020-10667-z.

[9] GARCÍA-LAFUENTE A, GUILLAMÓN E, VILLARES A, et al. Flavonoids as anti-inflammatory agents: Implications in cancer and cardiovascular disease [J]. Inflamm Res, 2009, 58(9): 537–552. doi: 10. 1007/s00011-009-0037-3.

[10] UDDIN S J, GRICE D, TIRALONGO E. Evaluation of cytotoxic activity of patriscabratine, tetracosane and various flavonoids isolated from the Bangladeshi medicinal plant[J]. Pharm Biol, 2012, 50(10): 1276–1280. doi: 10.3109/13880209.2012.673628.

[11] ZAKARYAN H, ARABYAN E, OO A, et al. Flavonoids: Promising natural compounds against viral infections [J]. Arch Virol, 2017, 162(9): 2539–2551. doi: 10.1007/s00705-017-3417-y.

[12] SINGH R, LU R, HU M. Flavonoids interference in common protein assays: Effect of position and degree of hydroxyl substitution [J]. Anal Biochem, 2020, 597: 113644. doi: 10.1016/j.ab.2020.113644.

[13] ZENG X Q, XI Y, JIANG W B. Protective roles of flavonoids and flavonoid-rich plant extracts against urolithiasis: A review [J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2019, 59(13): 2125–2135. doi: 10.1080/10408398.2018. 1439880.

[14] SHEN Y X. MYB transcription factors regulate flavonoid-mediated stress response in[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2019. [申玉晓. 玫瑰MYB转录因子调控类黄酮介导的逆境响应机制研究 [D]. 武汉: 华中农业大学, 2019.]

[15] YANG M. Study on the biosynthesis mechanism of flavonoids in different growth stages of[D]. Wuhan: Hubei Universitity of Chinese Medicine, 2020. [杨敏. 大叶蛇葡萄不同生长期黄酮类化合物的生物合成机制研究 [D]. 武汉: 湖北中医药大学, 2020.]

[16] LI H. Molecular mechanisms underlying the difference of pigmentation in mulberry fruits [D]. Chongqing: Southwest University, 2020. [李寒. 桑葚着色差异形成的分子机制 [D]. 重庆: 西南大学, 2020.]

[17] WEN K M, FANG X C, YANG J L, et al. Recent research on flavonoids and their biomedical applications [J]. Curr Med Chem, 2021, 28(5): 1042–1066. doi: 10.2174/0929867327666200713184138.

[18] FISCHER T C, MIRBETH B, RENTSCH J, et al. Premature and ectopic anthocyanin formation by silencing of anthocyanidin reductase in strawberry (×) [J]. New Phytol, 2014, 201(2): 440–451. doi: 10.1111/nph.12528.

[19] TIAN L, WAN S B, PAN Q H, et al. A novel plastid localization of chalcone synthase in developing grape berry [J]. Plant Sci, 2008, 175 (3): 431–436. doi: 10.1016/j.plantsci.2008.03.012.

[20] WEN W W, ALSEEKH S, FERNIE A R. Conservation and diversi- fication of flavonoid metabolism in the plant kingdom [J]. Curr Opin Plant Biol, 2020, 55: 100–108. doi: 10.1016/j.pbi.2020.04.004.

[21] BRÜGGER B P, MARTÍNEZ L C, PLATA-RUEDA A, et al. Bio- activity of the(Poaceae) essential oil and its terpenoid constituents on the predatory bug,(Heteroptera: Pentatomidae) [J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 8358. doi: 10. 1038/s41598-019-44709-y.

[22] AJAYI E O, SADIMENKO A P, AFOLAYAN A J. GC-MS evaluation of(DC) Stapf oil obtained using modified hydrodistillation and microwave extraction methods [J]. Food Chem, 2016, 209: 262–266. doi:10.1016/j.foodchem.2016.04.071 .

[23] FERIOTTO G, MARCHETTI N, COSTA V, et al. Chemical compo- sition of essential oils froms,, and, and their effects on the HIV-1 tat protein function [J]. Chem Biodiv, 2018, 15(2): e1700436. doi: 10.1002/cbdv. 201700436.

[24] WANG A M, LI R S, REN L, et al. A comparative metabolomics study of flavonoids in sweet potato with different flesh colors (s (L.) Lam) [J]. Food Chem, 2018, 260: 124–134. doi: 10.1016/ j.foodchem.2018.03.125.

[25] CALIS Z, MOGULKOC R, BALTACI A K. The roles of flavonols/ flavonoids in neurodegeneration and neuroinflammation [J]. Mini Rev Med Chem, 2020, 20(15): 1475–1488. doi: 10.2174/13895575 19666190617150051.

[26] YANG M, ZHOU P N, GUI C, et al. Comparative transcriptome analysis offor identifying genes involved in flavonoid biosynthesis and accumulation during different seasons [J]. Molecules, 2019, 24(7): 1267. doi: 10.3390/molecules24071267.

[27] ZHANG S P, QIU S L, HUANG H M, et al. Transcriptome and metabolome analyses of flavonoids metabolism in leaf, stem and root ofL. [J]. Acta Bot Boreali-Occid Sin, 2021, 41(2): 254–261. [张少平, 邱珊莲, 黄惠明, 等. 基于转录组和代谢组分析马齿苋根茎叶中类黄酮代谢[J]. 西北植物学报, 2021, 41(2): 254– 261. doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.2021.02.0254.]

[28] ZHANG S P, HONG J J, QIU S L, et al. Sequencing and analysis of the transcriptome of[J]. Acta Hort Sin, 2016, 43(5): 935– 946. [张少平, 洪建基, 邱珊莲, 等. 紫背天葵高通量转录组测序分析 [J]. 园艺学报, 2016, 43(5): 935–946. doi: 10.16420/j.issn.0513- 353x.2016-0140.]

[29] FENG C Y, LI S S, TAGUCHI G, et al. Enzymatic basis for stepwise-glycosylation in the formation of flavonoid di--glycosides in sacred lotus (Gaertn.) [J]. Plant J, 2021, 106(2): 351–365. doi: 10.1111/tpj.15168.

[30] RUSSO B, PICCONI F, MALANDRUCCO I, et al. Flavonoids and insulin-resistance: From molecular evidences to clinical trials [J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(9): 2061. doi: 10.3390/ijms20092061.

[31] BABU P V A, LIU D M, GILBERT E R. Recent advances in under- standing the anti-diabetic actions of dietary flavonoids [J]. J Nutr Biochem, 2013, 24(11): 1777–1789. doi: 10.1016/j.jnutbio.2013.06.003.

[32] ZHAO Y, YANG X Y, ZHAO X D, et al. Research progress on regulation of plant flavonoids biosynthesis [J]. Sci Technol Food Ind, 2021, 42(21): 454−463. [赵莹, 杨欣宇, 赵晓丹, 等. 植物类黄酮化合物生物合成调控研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 42(21): 454− 463. doi: 10.13386/j.issn 1002-0306.2020100095.]

Effects of Shading on Secondary Metabolites and Their Synthase Genes of Flavonoid in

ZHANG Shaoping, JU Yudong*, LI Zhou, LIAN Dongmei, WU Songhai, LAI Zhengfeng, HONG Jianji

(Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian, China)

In order to understand the gene information of flavonoids and their synthase in, the metabolome, transcriptome and qRT-PCR were studied by using young leaves ofgrowing in sunlight and shade. The results showed thatcontained 69 flavonoids belonging to 11 kinds. The contents of flavonoids, such as rutin, demethyltorosaflavone, astragalin and glucosylorobol etc., decreased under shade environment. The flavonoid biosynthesis involved 10 kinds of enzymes encoded by 54 genes. The expressions of 4 genes, such as(c99177.1), decreased significantly under shade environment, while those of 6 genes, such as(c51975.0) etc., were opposite. The up- or down-regulation expression trend of 5 flavonoid synthase genes under light and shading was consistent with the change ofFPKM in transcriptome sequencing, however, there was difference in the differential expression multiples between the two methods. Therefore, Shading could decrease the relative content of flavonoid in, but the relative expression of synthetase genes was irregular whether up or down regulation.

; Flavonoid; Metabolite; Synthase; Transcriptome; Metabolome

10.11926/jtsb.4658

2022-04-21

2022-06-17

福建省公益类科研院所专项(2020R1030001)；福建省农业科学院青年创新团队项目(CXTD2021006-3)；福建省农业科学院科技创新平台专项(CXPT202103)资助

This work was supported by the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2020R1030001), the Project for Youth Innovation Team of FAAS (Grant No. CXTD2021006-3), the Special Project for Platform for Science and Technology Innovation of FAAS (Grant No.CXPT202103).

张少平(1975年生)，男，硕士，高级农艺师，主要从事功能植物次生代谢产物研究。E-mail: zspnc@163.com

. E-mail: 303443553@.qq.com