三子养亲汤调控TGF-β1/Smad2/3 信号通路抑制哮喘模型小鼠气道上皮间质转化的作用机制研究

张 慧 葛海波

（南京中医药大学附属南京中医院，江苏南京 210022）

近年来，哮喘的患病率逐年上升，目前全球已有3 亿人患有哮喘，预计到2025 年哮喘的患病率将达到4 亿人[1]。庞大的哮喘患病人群以及居高不下的死亡率使得哮喘成为世界范围内的重大公共卫生问题。目前，哮喘的基础治疗包括使用皮质类固醇、β2受体激动剂和白三烯拮抗剂，这些药物可减轻炎症，但在预防和逆转气道重塑方面无明显疗效[2]。在哮喘发病过程中预防气道重塑具有降低疾病严重程度、控制和预防疾病进展的潜力。因此，寻找抑制哮喘气道重塑的药物是哮喘治疗的关键所在。

相关研究表明，上皮细胞间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）在哮喘气道重塑的发生中起着重要作用[3]。EMT是一种与上皮极性丧失、间充质标志物表达及流动性增强、细胞外基质重塑相关的细胞状态，如紧密和贴壁连接以及上皮标记物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少，并获得间充质特性，即N-钙黏蛋白（N-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达增加，使得上皮细胞在此期间失去上皮特征。转化生 长 因 子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）分泌聚集及其活化的细胞信号转导分子2/3（mothers against decapentaplegic homolog2/3，Smad2/3）蛋白的免疫反应性增加是导致EMT的关键信号通路[4]。与正常上皮细胞相比，来自哮喘患者的原代气道上皮细胞在TGF-β1干预下会导致E-cadherin的缺失及Smad2/3磷酸化水平的增加[5]。因此，抑制TGF-β1及其下游Smad2/3信号通路，减少气道EMT是干预哮喘发生、发展的关键分子机制。三子养亲汤出自《韩氏医通》，由紫苏子、白芥子、莱菔子3 味中药组成，为著名的温化寒痰方剂。现代研究发现本方对哮喘中证见痰壅气滞者有显著疗效，可有效改善患者肺功能，缓解症状，并能稀释痰质以助黏痰排出[6-7]。机制研究发现，三子养亲汤可减轻哮喘患者气道重塑[8]，但其具体作用机制尚未阐明。本研究拟制备哮喘小鼠模型，观察三子养亲汤对TGF-β1/Smad2/3 信号通路的干预作用以深入探索本方抑制哮喘气道EMT的作用机制，以期为三子养亲汤治疗哮喘提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 40只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雌性16～18周龄Balb/c小鼠，体质量（18±2）g，购自浙江维通利华实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001。动物饲养及实验过程遵循实验动物福利3R原则，经南京中医药大学实验动物伦理委员会审批通过。

1.2 实验药物 三子养亲汤（白芥子9 g，紫苏子9 g，莱菔子9 g），药物饮片购自上海真仁堂药业有限公司。将中药饮片置于煎药陶罐中浸泡1 h，水煎2次，合并煎出液后浓缩，用纯净水配置成生药含量1.08 g/mL、0.54 g/mL的溶液，置于4 ℃冰箱中备用。地塞米松（批号：HY-14648）购自美国MCE公司，规格500 mg，用纯净水配置成浓度为0.075 mg/mL的溶液，置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 主要试剂 细胞裂解液（批号：P10013B）、磷酸酶抑制剂（批号：P1081）、蛋白酶抑制剂（批号：P1010）、BCA蛋白定量试剂盒（批号：P0010）、ECL发光液（批号：P0018S）及苏木素伊红（HE）染色试剂盒（批号：C0105S）购自上海碧云天生物技术有限公司；E-cadherin（批号：14472）、N-cadherin（批 号：13116）、β-actin（批 号：3700）、TGF-β1（批号：3711）、Smad2（批号：5339）、Smad3（批号：9523）、磷酸化Smad2（P-Smad2，批号：3104）、磷酸化-Smad3（P-Smad3，批号：9520）抗体购自美国CST公司；α-SMA（批号：14395）、GAPDH（批号：60004-1）购自武汉三鹰生物技术有限公司；鸡卵白蛋白（Ovalbumin，OVA，批号：A5503）、硫酸铝钾十二水合物（批号：237086）、氯化乙酰甲基胆碱（Mch，批号：A2251）购自美国sigma公司；小鼠抗卵清蛋白免疫球蛋白E（IgE）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（批号：JL23405）购自上海江莱生物科技有限公司。1.4 主要仪器 全自动多功能酶标仪（型号：DK-3506），购自德卡精密量仪（深圳）有限公司；凝胶成像仪（型号：GelDoc XR+），购自美国伯乐公司；CO2电热恒温细菌细胞培养箱（型号：HCP-80S），购自广州市康恒仪器有限公司；光学显微镜（型号：BX53M），购自日本Olympus公司；电子天平（型号：CP214），购自美国奥豪斯公司；垂直电泳仪（型号：1658033），购自美国伯乐公司；无创肺功能仪（型号：Link Master），购自英国EMMS公司。

2 实验方法

2.1 分组与造模、给药 小鼠适应性喂养1周后随机分为正常组、模型组、地塞米松组及三子养亲汤低、高剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组小鼠参考ZENG L W等[9]的实验方法构建哮喘小鼠模型：于造模第1天及第14天腹腔注射100 µL致敏液（OVA 1 mg/mL及硫酸铝钾0.2 g/mL混合液）致敏，造模第14、25、26、27天予1 mg/mL OVA 25 µL滴鼻激发，两侧鼻孔各滴入12.5 µL。正常组小鼠同期予等量无菌生理盐水腹腔注射，等量生理盐水滴鼻。造模开始后第14至27天，三子养亲汤低、高剂量组分别予三子养亲汤5.4 g/（kg·d）、10.8 g/（kg·d）灌胃，地塞米松组予地塞米松0.75 mg/（kg·d）灌胃，正常组及模型组予等量无菌水灌胃，每只小鼠灌胃体积为0.2 mL（以小鼠体质量20 g计算），连续灌胃14 d。造模后各造模小鼠均出现点头、挠鼻、烦躁不安等行为，表明造模成功。

2.2 取材 末次OVA滴鼻激发后24 h，每组随机选取6只小鼠进行肺功能检测，随后所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血约800 µL，室温静置1 h后1200×g离心10 min，留取上清-80 ℃保存。随后各组小鼠脱颈椎处死，迅速打开胸腔取左上肺叶置于4%多聚甲醛中固定，用于肺组织病理染色；摘取右上肺叶置于液氮中保存，用于蛋白免疫印迹（Western blot）法检测。

2.3 指标检测

2.3.1 全身体积描记系统检测各组小鼠肺功能 通过全身体积描记系统对各组小鼠进行活体呼吸参数测量。每组取6只小鼠依次放入全体容积描计箱内，以浓度为0、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/mL的Mch雾化1 min后，测定激发5 min内小鼠支气管收缩参数增强呼吸间歇（enhanced pause，Penh），以衡量小鼠气道高反应性。

2.3.2 ELISA法检测各组小鼠血清IgE 取每组6只小鼠血清，严格按照试剂盒说明书，使用多功能酶标仪于450 nm波长下检测OD值，并根据标准曲线计算血清IgE含量。

2.3.3 HE染色观察各组小鼠肺组织病理 取每组3只小鼠左上肺叶置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，沿矢状面切片，厚度约4 µm，参照试剂盒说明进行HE染色，中性树脂胶封片后显微镜下观察并拍照。

2.3.4 Western blot法检测各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平 取每组6 只小鼠右上肺叶加入预混蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，研磨；将组织蛋白置于4 ℃低温离心机13 500×g离心20 min后取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；加入上样缓冲液后100 ℃加热变性5 min；蛋白样本行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后加入一抗（E-cadherin、N-cadherin、

α-SMA、β-actin，稀释比例1∶1000），4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次摇床孵育5 min；加山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（稀释比例1∶5000），室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL发光液置于凝胶成像仪，以β-actin为内参通过Image J软件计算目的蛋白相对表达量。

2.3.5 Western blot法检测各组小鼠肺组织TGF-β1/Smad2/3信号通路相关蛋白表达水平 取2.2.4项下各组6只小鼠肺组织蛋白样本，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后加入一抗（TGF-β、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、GAPDH，稀释比例1∶1000），4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次摇床孵育5 min。加山羊抗兔IgG（稀释比例1∶5000），室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL发光液并置于凝胶成像仪中，以GAPDH为内参通过Image J软件计算目的蛋白相对表达量，以P-Smad2/Smad2和P-Smad3/Smad3反映Smad2/3磷酸化激活情况。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，实验数据均为计量资料且均符合正态分布，采用均值±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠肺功能比较 如表1所示，予3.125、6.250、12.500、25.000 g/L的Mch雾化激发后，模型组小鼠Penh值显著高于正常组（P＜0.01），地塞米松组小鼠Penh值明显低于模型组（P＜0.01）；予25.000 mg/mL Mch雾化激发后，三子养亲汤高剂量组小鼠Penh值明显低于模型组（P＜0.01）。予不同浓度Mch雾化激发后，地塞米松对哮喘模型小鼠Penh值的干预作用优于三子养亲汤各剂量组，部分数值组间比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），三子养亲汤各剂量组小鼠Penh值组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠肺功能Penh值比较（±s）

表1 各组小鼠肺功能Penh值比较（±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与地塞米松组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别动物数/只Penh值0 g/L Mch3.125 g/L Mch6.250 g/L Mch 12.500 g/L Mch 25.000 g/L Mch正常组60.58±0.100.88±0.091.37±0.201.69±0.162.30±0.29模型组60.58±0.291.54±0.25**2.48±0.32**2.84±0.26**4.55±0.36**三子养亲汤低剂量组60.46±0.191.41±0.252.37±0.15▲▲2.79±0.49▲▲ 3.98±0.65▲▲三子养亲汤高剂量组60.53±0.171.20±0.172.05±0.612.60±0.25▲3.57±0.19△△▲地塞米松组60.52±0.141.11±0.28△△1.56±0.08△△2.00±0.32△△ 2.75±0.48△△

3.2 各组小鼠血清IgE水平比较 模型组小鼠血清IgE水平明显高于正常组（P＜0.01），三子养亲汤低剂量组、地塞米松组小鼠血清IgE水平明显低于模型组（P＜0.05），各给药组组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 各组小鼠血清IgE水平比较（x-±s）

3.3 各组小鼠肺组织病理表现 HE染色结果提示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织炎症水平增加，气道平滑肌增厚，气道上皮细胞排列紊乱伴部分上皮细胞脱落，气道黏液分泌增加。与模型组比较，各给药组小鼠气道炎症水平改善，平滑肌增厚减少，气道上皮细胞排列有序、脱落减少，其中以三子养亲汤高剂量组及地塞米松组改善更为显著。详见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理表现（HE，×200）

3.4 各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平比较 模型组小鼠肺组织N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平显著高于正常组（P＜0.01），E-cadherin蛋白表达水平显著低于正常组（P＜0.01）。三子养亲汤高剂量组及地塞米松组小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达水平显著高于模型组（P＜0.01），三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白表达水平均显著低于模型组（P＜0.01），各给药组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达水平均显著低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。其中，三子养亲汤高剂量组小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达水平明显高于低剂量组（P＜0.01），三子养亲汤高剂量对小鼠肺组织N-cadherin蛋白表达水平的改善，三子养亲汤各剂量对α-SMA蛋白表达水平的改善均明显优于地塞米松（P＜0.05，P＜0.01）。详见表3、图2。

图2 各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白电泳图

表3 各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白相对表达量比较（x-±s）

3.5 各组小鼠肺组织TGF-β1/Smad2/3信号通路相关蛋白表达水平比较 模型组小鼠肺组织TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3 水平均显著高于正常组（P＜0.01，P＜0.05），三子养亲汤各剂量组小鼠上述指标水平均明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），而地塞米松则未表现出对上述指标的改善作用（P＞0.05）。三子养亲汤低剂量组小鼠肺组织TGF-β1 表达，三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织P-Smad2/Smad2 水平均明显低于地塞米松组（P＜0.05，P＜0.01）。详见表4、图3。

图3 各组小鼠肺组织TGF-β1/Smad2/3信号通路蛋白电泳图

表4 各组小鼠肺组织TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3相对表达量比较（x-±s）

4 讨论

哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，以慢性气道炎症、气道重塑以及气道高反应性为主要特征。其中，气道重塑引起的不可逆气道阻塞和肺功能恶化是导致哮喘反复发作的关键病理因素[10]。气道重塑的主要特征是气道上皮细胞增生及平滑肌肥大、增生和气道血管重构。研究表明，气道重塑与上皮间质转化功能障碍密切相关，在气道上皮屏障的损伤修复过程中，气道上皮细胞通过TGF-β1介导的信号通路参与了EMT的发生，通过介导呼吸道基底膜的增厚和细胞基质沉积导致气道壁的纤维化和增厚，从而参与气道重塑[11]。

哮喘属中医学“哮病”范畴。哮病之所以反复发作，难以治愈，是由于“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰”，三者相合，闭塞气道，搏击有声，发为哮病。“宿痰伏肺”是哮喘的宿根。哮喘反复发作，极易损伤气津，痰液更加黏稠难出，滞塞肺络，淤积不散，出现顽痰胶固，致肺管狭窄，使无形之气不能宣降，气道狭窄，致津、血运行受碍。这种痰气交阻的病理特征使病情迁延，缠绵难愈，与现代医学关于哮喘气道重塑细胞外基质沉积、支气管平滑肌增生、血管通透性增加、黏膜瘀血水肿、炎性分泌物增多，结果导致气道狭窄、缺血缺氧，严重影响气道通气功能的认识是一致的[12]。

三子养亲汤方中白芥子温肺豁痰、利气平喘；紫苏子止咳平喘，莱菔子消食除胀，两者均为降气化痰之要药。三药合用，使肺气宣降，咳喘得平，气顺则痰消。本研究以OVA诱导哮喘小鼠模型，结果显示造模后小鼠出现点头、挠鼻、烦躁不安等表现，气道炎性细胞浸润，气道平滑肌增厚，气道黏液分泌增加，气道上皮细胞排列紊乱，部分气道上皮细胞脱落，血清IgE及肺功能Penh值水平显著增加，且EMT相关蛋白检测结果提示上皮连接表型蛋白E-cadherin在肺组织中的表达量显著降低，而间充质表型相关蛋白N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平显著增高，提示OVA诱导的哮喘小鼠模型构建成功，模型小鼠具有气道EMT的病理表现。本研究结果表明，经三子养亲汤干预后，哮喘模型小鼠肺组织上皮细胞排列恢复整齐，气道上皮细胞脱落减少，同时EMT相关蛋白的表达回调，提示三子养亲汤可以保护哮喘模型小鼠上皮屏障，阻止哮喘气道EMT的发生与发展。与文献报道[2]相一致的是，本次研究同样发现三子养亲汤对于哮喘模型小鼠气道EMT相关蛋白的回调作用优于地塞米松。

TGF-β1是一种多效性细胞因子，参与细胞成熟分化、胚胎发育、炎症、免疫调节、伤口愈合、组织重塑修复等众多关键过程，而在哮喘的病理过程中，TGF-β1主要参与气道炎症反应和纤维化组织重塑，表现为免疫反应的增强和支气管壁不同层的支气管重构，包括气道EMT改变[13-14]。研究发现，哮喘患者肺活检组织及支气管肺泡灌洗液中TGF-β1水平升高，且TGF-β1的升高与气道厚度密切相关[15-16]。TGF-β1通过多种不同的信号通路发挥作用，包括Smad依赖性、非Smad依赖性和β-连环蛋白信号通路。Smad依赖性信号通路是TGF-β1的典型信号通路，TGF-β1通过与TGF-β1 Ⅱ型受体（TβRⅡ）结合，进而磷酸化TGF-β1 Ⅰ型受体（TβRⅠ），通过TβRⅠ活化进一步磷酸化激活Smad信号因子。Smad2/3 被认为是TGF-β1信号促气道EMT和组织纤维化中的关键调节因子[17]。WNUK D等[18]研究发现，与健康供体相比，哮喘患者的成纤维细胞中TGF-β1诱导的促纤维化Smad2/3 信号通路的激活增强，对抗纤维化Smad1/5/9 信号通路的激活明显减弱。本研究探究了三子养亲汤对TGF-β1及下游经典信号通路Smad2/3的调控作用，发现三子养亲汤可以抑制OVA诱导的哮喘模型小鼠肺组织Smad2/3 信号通路的磷酸化激活与TGF-β1表达，而地塞米松对哮喘小鼠肺组织TGF-β1/Smad2/3 信号通路的调控作用明显低于三子养亲汤，进一步提示了三子养亲汤可能通过干预TGF-β1/Smad2/3 信号通路抑制哮喘气道EMT的发生。同时，本研究发现三子养亲汤对上述指标的干预作用并未表现出明显的剂量依赖性，分析可能与实验小鼠的个体变异性以及药物浓度梯度不足相关，在接下来的研究中可通过提高样本量及增加中药浓度梯度的方式进一步提高三子养亲汤治疗哮喘相关研究的科学性及严谨性。

综上，本研究结果表明三子养亲汤可抑制哮喘小鼠的气道EMT改变，其调控机制可能与下调TGF-β1表达，抑制Smad2/3信号通路激活有关。“调气”与“化痰”均为三子养亲汤治疗哮喘的重要治则治法，本课题组在接下来的研究中将通过拆方及单味药研究、转录组学等方式进一步探究“调气”与“化痰”的相关性及其分子内涵。