实时荧光定量PCR 鉴定食品中绿豆源性成分

王 成，徐石勇，李 纳，王雅偲，陈 锐，兰青阔，王 永，赵 新

（1.天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所，天津 300381；2.天津农学院园艺园林学院，天津 300392）

绿豆［Vigna radiata（L.）Wilczek］是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionoideae）豇豆属（Vigna）一年生直立草本植物，原产于中国［1］，在非洲、南美洲和亚洲其他地区也被广泛种植［2］。绿豆是中国传统的食用豆类作物，具有药食两用性［3，4］。绿豆作为中药材，具有消暑利水、清热解毒、保肝明目等功效［5-8］；作为食品，可制作成各种风味小吃，如绿豆糕、绿豆饼干等。同时，绿豆的直链淀粉含量较高且具有高交联特性，是淀粉类食品的优质原料［9］。但绿豆也是引发过敏性喉头水肿的过敏原之一，在中国已有相关报道［10］。

传统的食品检测技术包括化学比色法、酶联免疫法、免疫胶体金法等。这些方法成本低，易于操作。随着分子生物学技术的逐渐成熟，PCR 方法因其特异性强和灵敏度高而备受关注［11］。其中，实时荧光定量PCR 技术（Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）通过收集荧光信号可以实时监测生成的PCR 产物［12］。与传统方法相比，qPCR 的优势在于，不仅可对目标物进行定性判别，还可通过绘制标准曲线分析目标物的含量。TaqMan 探针法是常用的方法之一。利用该项技术，前人已在多项研究中实现了对不同目标物的定量检测［13-21］。但目前对绿豆成分的检测以定性方法居多。因此，本研究旨在建立一种精准、灵敏的绿豆源性成分定量检测方法，在弥补相关检测方法空白的同时，为食品掺伪检测及过敏原成分筛查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆、豌豆（Pisum sativumL.）、豇豆［Vigna unguiculata（Linn.）Walp］、赤小豆（Vigna umbellata）、蚕豆（Vicia fabaL.）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、鹰嘴豆（Cicer arietinumLinn.）、花生（Arachis hypogaeaLinn.）、大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］、玉米（Zea maysL.）、水稻（Oryza sativaL.）、小麦（Triticum aestivumL.）均由天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所提供。高效植物基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司生产；PremixEx TaqTM（Probe qPCR）为大连宝生物科技有限公司生产；引物、探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

CFX96 型实时荧光PCR 仪为Bio-Rad 公司生产；NanoDrop 1000 型超微量分光光度计为Thermo Fisher Scientific 公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 引物、探针的设计与筛选 利用NCBI网站资源，结合生物信息学技术，下载并比对绿豆及其近缘种的基因组序列，从中筛选绿豆物种特异性序列。应用Primer Express v3.0 软件设计引物、探针，并对目的片段同源性进行BLAST 分析。符合要求的引物、探针被合成后进行特异性筛选，反应条件如表1所示。反应程序：95 ℃变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s，循环数≥40；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。

表1 用于引物、探针筛选的qPCR 反应体系

1.2.2 qPCR 反应条件的优化 为了得到最优的qPCR 反应条件，利用筛选出的引物、探针，分别设置52、54、56、58、60 ℃的退火温度梯度，并在每个退火温度下分别设置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L 的引物浓度梯度（探针浓度减半），进行qPCR 反应。根据结果，选择扩增曲线相对荧光量最高且Ct最小的一组进行后续试验。

1.2.3 检出限和定量限的测试 检出限（Limit of detection，LOD）：根据前人研究经验，同时考虑qPCR法的灵敏度高于普通PCR 法，因此将绿豆DNA 混入由非绿豆样品DNA 组成的DNA 池中，制备出绿豆含量为0.05%和0.01%的2 份DNA 样品，每份样品进行60 次测试，根据测试结果，确定方法的检出限。定量限（Limit of quantification，LOQ）：利用同样的方法，制备15 份绿豆含量为0.1%的DNA 样品，进行定量限测试，计算标准差（SD）和相对标准偏差（RSD），根据测试结果确定方法的定量限。

1.2.4 定量标准曲线的建立及应用 将100%绿豆基因组DNA 依次进行5 倍稀释，形成100.00%、20.00%、4.00%、0.80%和0.16%的5 个定量校准点，利用目的基因建立定量标准曲线，考察其线性相关性、扩增效率等指标是否符合预期。将绿豆粉末混入非绿豆粉末中，配制绿豆含量分别为10%、5%和1%的模拟样品。同时，从农贸市场购买市售绿豆制品，利用标准曲线对2 种样品中的绿豆源性成分进行定量分析，并对定量值的标准差和相对标准偏差进行评价。

2 结果与分析

2.1 引物、探针设计与筛选结果

对绿豆及其同亚科8 种近缘种的基因组序列分析后发现，在绿豆第1 染色体上存在绿豆基因组特异性序列（序列ID：106757947）。通过软件设计及BLAST 分析，确定了4 对同源性较高的引物、探针组合。以绿豆含量为100.00%的基因组DNA 为模板，对上述4 对引物、探针组合进行筛选。结果显示，在相同扩增条件下，LD1-QF/QR/P 组合的相对荧光量最高且Ct最小（图1、表2），因此利用该组合进行特异 性 测 试。 序 列 信 息：LD1-QF：5′-CGGACCGTTCAAGGAGAGTATC-3′ ；LD1-QR：5′-CGGCTGTCCGTTCTCGTAAC-3′ ；LD1-P：5′-FAM-CCGTACGCCCCCAACCACGA-BHQ1-3′。在特异性测试中，除绿豆物种外，其余11 个非绿豆物种均未出现典型的扩增曲线，表明LD1-QF/QR/P 组合对绿豆具有较好的物种特异性（图2）。

图1 引物、探针的筛选结果

图2 LD1-QF/QR/P 组合的特异性测试结果

表2 引物、探针的筛选结果

2.2 qPCR 反应条件的优化结果

随着退火温度的升高，各浓度梯度的Ct均呈下降趋势（图3、表3），表明较高的退火温度有利于提高扩增效率。而在各梯度的退火温度中，扩增曲线的Ct随引物、探针浓度的加大呈先降后升的趋势，即分别在引物浓度为0.4、0.6 μmol/L 时扩增效率较高，且二者差异并不明显。因此，从试验的经济性方面考虑，选择0.4 μmol/L 作为反应体系的引物终浓度（探针浓度减半），60 ℃作为引物、探针组合的退火温度。

图3 qPCR 反应条件的优化结果

表3 qPCR 反应条件的优化结果

2.3 检出限和定量限的确定

绿豆含量为0.05%的60 份样品全部出现扩增信号（图4）；而绿豆含量为0.01%的60 份样品中，只有44 份样品出现扩增信号，不能满足方法的需要，因此将本方法的绿豆源性成分检出限（LOD）确定为0.05%。在定量限测试中，15 份绿豆含量为0.1%的样品的定量结果的标准差和相对标准偏差均小于25%（图5），满足方法的需要，因此将本研究的定量限（LOQ）确定为0.1%绿豆含量。

图4 检出限测试结果

图5 定量限测试结果

2.4 定量标准曲线的建立及应用结果

由图6 可知，建立的标准曲线具有良好的线性相关性（y=-3.314x+39.753，R2=1.000，其中，y为Ct，x为起始模板量）和扩增效率（E=100.3%）。参照相关方法的制定指南（农业部2259 号公告-5-2015），技术指标均符合要求。利用建立的定量标准曲线分别对3 份模拟样品和2 份市售绿豆制品中的绿豆基因组DNA 进行相对定量测试，结果如表4 所示。由表4 可知，所有样品的相对定量结果重复性均较好，定量值的标准差和相对标准偏差均小于25%，表明本研究建立的实时荧光定量PCR 检测方法有较高的精确度。

图6 标准曲线的建立

3 小结与讨论

目前，市售的绿豆制品种类繁多，且多为深加工品，不良商家以价格低廉的豆科作物取代绿豆，仅凭肉眼观察很难分辨真伪。目前对于绿豆成分的检测主要是基于核酸的检测方法，其中PCR 方法是应用较多的鉴定方法之一。赵仲麟等［22］利用绿豆mgQ062FRFLP 设计引物，可从21 种不同豆类作物中特异性鉴定出绿豆物种。虽然本研究用于特异性测试的豆科作物只有8 种，但均为绿豆近缘种，且经济价值均低于绿豆，更符合实际情况。此外，该方法的检出限达到了0.05%，较之前的方法提高了10 倍，表明能够从绿豆含量更低的样品中检测出目标物种，降低了错检风险。粟智平等［23］同样采用普通PCR 技术实现了对粉丝中绿豆、豌豆、玉米、甘薯与马铃薯5 种植物源性成分的定性检测。在本研究中，市售绿豆糕样品中绿豆源性成分的定量结果与标识含量差异较大，结合其他样品的定量结果，定量值的标准差和相对标准偏差均小于25%，表明该方法的精确度能够满足检测的需要，在排除自身原因的情况下，推测该样品存在掺伪情况，但掺伪物质为何种作物并不明确，这也为后续开发多重植物源成分鉴定qPCR 方法提供了方向。环介导等温扩增（LAMP）技术也被经常运用到食品掺杂掺假检测当中，李梦媛等［24］建立了一种绿豆源DNA 的实时荧光定量LAMP 检测方法，能够将绿豆、大豆、玉米、木薯和马铃薯DNA 区分开。但该技术的设计引物需要较大的序列片段，而往往深加工食品中的DNA 片段较小，使其在深加工食品领域的应用受到了限制。本研究中目的片段大小仅为71 bp，可以适用于深加工食品中绿豆源性成分的检测。除此之外，谈超［25］利用酶联免疫（ELISA）技术实现了对食品中绿豆过敏原的定量检测，但该技术基于蛋白质水平，绿豆是淀粉制品的主要优质原料，而淀粉中不含有蛋白质，该方法同样具有局限性。因此，本研究方法的建立实现了对深加工品食品中绿豆源性成分的定量分析，弥补了前人方法的不足。

本研究建立的食品中绿豆源性成分鉴定实时荧光定量PCR 方法可从8 种常见豆科植物和3 种主要粮食作物中特异性鉴定出绿豆物种，同时，结合定量标准曲线能够实现食品中绿豆源性成分的定量测定，检出限达0.05%，定量限达0.1%，具有较高的灵敏度和准确性。