响应面优化连翘叶总三萜提取工艺及其抗肿瘤活性研究

王学方，陈 玲，归 荣，宁二娟，王 伟，王学兵，李 晓

（1.河南省纳普生物技术有限公司，郑州 450002；2.河南农业大学动物医学院，郑州 450000）

连翘叶为木犀科植物连翘（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）的干燥叶，在中国民间已有较长的药用历史［1］，古典典籍《玉樵医令》中记载：“连翘叶，味苦，性寒，可泻火，入心肺二经”。在《中药大辞典》和《中华本草》等近代典籍中，对连翘叶的描述是“连翘茎叶具有清热、解毒之功效”。在中国，目前人们仅把它当作茶叶来饮用，用于咽喉肿痛等症［2］。连翘叶富含木脂素、连翘酯苷A、熊果酸等化合物，具有调节血脂、抗疲劳、抗衰老和抗流感等多种保健作用［3］，有研究表明连翘叶有可能作为药用部位连翘果实的补充和替代，也可以作为中草药饲料添加剂用于兽医临床等，应用前景十分广阔，具有很高的社会意义和商业价值［4］。

连翘叶中含有丰富的三萜类化合物，如熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸等，且含量均高于连翘果实［5，6］。大量研究表明熊果酸具有抗炎、镇静、抗肿瘤、抗糖尿病、扩张血管和增强机体免疫力等作用；齐墩果酸具有保肝、降血糖、抗HIV 和抗肿瘤等功效；白桦脂酸具有消炎、杀菌、抗疟疾、抗肿瘤和神经系统保护作用等功效［7，8］。经查阅文献，未见对连翘叶总三萜的提取工艺与抗肿瘤活性研究［9-14］。鉴于此，本试验采用响应面法考察了连翘叶总三萜的超声波提取工艺，并进一步利用大孔树脂富集纯化，同时检测其抗肿瘤活性，为连翘叶资源的科学开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

连翘叶采自河南省栾川县，自然晒干，粉碎过筛（20 目）备用；人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231 细胞，肝癌HepG2、SNU-739 细胞，结肠癌HT29、HCT116细胞和正常肝细胞HL-7702 均购自上海中科院细胞库；DMEM、RPMI1640 培养液、青链双抗和胎牛血清（Gibco 公司）；CCK-8（大连美仑生物技术有限公司）；齐墩果酸对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：19111301）；熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110742-201622）；白桦脂酸对照品（四川中草药标准物质研究中心，批号：200804）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

UC-15B 型超声波清洗机（功率360 W，频率50 kHz），游目仪器（上海）有限公司；RE100-S 型旋转手动蒸发仪，大龙兴创仪器有限公司；DLSB-5L/20 型低温冷却循环泵，巩义市予华仪器有限责任公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；NBS-U410 型超低温冰箱、NBS-170S 型二氧化碳培养箱，Eppendorf 公司；1300 SERIES A2 型生物安全柜，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LC-20AD 型高效液相色谱仪系统，日本株式会社岛津制作所。

1.3 方法

1.3.1 连翘叶总三萜提取工艺流程 连翘叶→干燥→粉碎→过筛（20 目）→称重→超声提取→过滤→减压浓缩干燥→连翘叶总三萜粗样品粉末→总三萜粗品溶液→大孔树脂富集纯化→减压浓缩干燥→连翘叶总三萜纯化品。

1.3.2 连翘叶总三萜的含量测定 根据2020 年版《中华人民共和国药典》［15］灵芝三萜含量测定的方法，并结合提取三萜相关文献的报道方法［12］，确定本研究采用紫外分光光度法测定连翘叶中总三萜的含量。

1）标准曲线的绘制。精密称定齐墩果酸对照品1.96 mg，加乙醇制成每1 mL 含196 μg 的溶液，吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、0.90 mL 上述对照品溶液，分别置于10 mL 具塞试管中，75 ℃烘箱挥干溶剂后，精密加入0.2 mL 新配制的香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，震摇均匀后置于70 ℃水浴中加热25 min，取出冷却至室温，加入乙酸乙酯4 mL，震摇均匀，于546 nm 波长处测定吸光度。得回归方程为y＝0.011 6x-0.013 7（R2＝0.993 6）。

2）连翘叶总三萜测定及提取率的计算。根据“1.3.2”项下回归方程，计算连翘叶总三萜提取样品中总三萜的含量，提取率计算公式为：

式中，X表示根据标准曲线计算出样品中的齐墩果酸含量（%）；m表示提取样品质量（g）；M表示连翘叶粉末质量（g）。

1.3.3 连翘叶总三萜中熊果酸、齐墩果酸和白桦脂酸的含量测定

1）供试品溶液的配制。精密称取纯化后连翘叶总三萜样品0.021 3 g，置50 mL三角瓶中，加入10 mL的95%乙醇溶液，称其质量后，超声30 min，使其溶解，放冷，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2）标准溶液的配制。分别精密称取熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸标准品适量，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 分别含0.200 3、0.170 1、0.204 8 mg 对照品的储备液，4 ℃冰箱保存，备用。

3）HPLC 检 测条 件。色 谱柱：Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1 mol/L 乙酸铵溶液（85∶15）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm，进样量：10 μL。

1.3.4 单因素试验 分别设置不同的乙醇浓度、料液比、提取时间以及温度，探究其对连翘叶总三萜提取率的影响。

1.3.5 响应面试验 在单因素试验的基础上，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）这4 个因素作为响应因子，以总三萜提取率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6 软件设计4 因素3 水平响应面试验。因素水平见表1。

1.3.6 连翘叶总三萜大孔树脂富集纯化 选择6 种大孔树脂进行试验，研究不同型号大孔树脂对连翘叶总三萜纯化的影响，取最佳超声工艺提取的连翘叶总三萜粗样品适量，加水超声溶解，制成浓度为100 mg/mL 的样液200 mL。取预处理好的大孔树脂100 g 湿法装入3 cm×70 cm 色谱柱中，按1.5 mL/min的流速将配制好的连翘叶总三萜粗样品溶液缓慢上柱，再用去离子水快速冲至流出液无色；然后先用65%乙醇溶液进行洗脱，再用体积分数为95%的乙醇溶液以流速2.0 mL/min 进行洗脱，收集95%乙醇洗脱液。将95%乙醇洗脱液减压浓缩至干，得到连翘叶总三萜干燥粉末，用于抗肿瘤活性测定，并用HPLC 测定其总三萜、熊果酸、齐墩果酸和白桦脂酸的含量。

1.3.7 连翘叶总三萜的抗肿瘤活性研究 以米托蒽醌为阳性对照，采用CCK-8 法测定其对人乳腺癌MCF-7 细 胞 和MDA-MB-231 细 胞、肝 癌HepG2 细胞和SNU-739 细胞、结肠癌HT29 细胞和HCT116 细胞及正常肝细胞HL-7702 细胞的抗肿瘤活性。细胞在DMEM 和RPMI1640 培养基（含10%胎牛血清、50 IU/mL 青霉素和50 μg/mL 链霉素）中培养，并保持在37 °C。取正处于对数生长期的细胞于96 孔平底板中，每孔放置2.5×104个细胞。培养24 h 后，用含有不同浓度受试样品的培养基代替生长培养基。孵 育48 h 后，弃 去 原 培 养 基，加 入100 μL 的10%CCK-8 溶液（培养基稀释），在培养箱中放置1.5~2.0 h。用酶标仪在450 nm 波长处检测其吸光度，并计算其IC50。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同乙醇浓度对连翘叶总三萜提取率的影响 固定料液比1∶35 g/mL，提取时间30 min，提取温度55 ℃，考察乙醇浓度分别为45%、55%、65%、75%、85%、95%时对连翘叶总三萜提取率的影响。由图1 可知，随着乙醇浓度的升高，连翘叶总三萜的提取率先快速升高后降低，在乙醇浓度75%时达到最大。

图1 乙醇浓度对连翘叶总三萜提取率的影响

2.1.2 不同料液比对连翘叶总三萜提取率的影响固定乙醇浓度75%，提取时间30 min，提取温度55 ℃，考察料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL 时对连翘叶总三萜提取率的影响。由图2可知，料液比对连翘叶总三萜提取率的影响不是很大，连翘叶总三萜提取率随提取溶剂的增大呈上升趋势，当料液比为1∶30 g/mL 时，连翘叶总三萜提取率已趋于稳定。因此，选取料液比为1∶30 g/mL。

图2 料液比对连翘叶总三萜提取率的影响

2.1.3 不同提取时间对连翘叶总三萜提取率的影响 固定乙醇浓度75%，料液比1∶30 g/mL，提取温度55 ℃，考察提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min 时对连翘叶总三萜提取率的影响。由图3 可知，随着提取时间的增加，连翘叶总三萜的提取率也逐渐升高，提取时间为40 min 时连翘叶总三萜提取率已达最高，随后出现下降的趋势，可能是由于提取时间过长，其他成分的溶出较多，以致于降低了总三萜的提取率。

图3 提取时间对连翘叶总三萜提取率的影响

2.1.4 不同提取温度对连翘叶总三萜提取率的影响 固定乙醇浓度75%，料液比1∶30 g/mL，提取时间40 min，考察提取温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃时对连翘叶总三萜提取率的影响。由图4 可知，随着提取温度的升高，连翘叶总三萜的提取率缓慢上升，当提取温度达50 ℃时，提取率最高；之后又缓慢降低，可能温度过高对总三萜的稳定性产生了影响，导致提取率下降。

图4 提取温度对连翘叶总三萜提取率的影响

2.2 响应面法优化连翘叶总三萜提取工艺

2.2.1 响应面试验方案与结果 根据Box-Behnken中心组合设计进行试验，不同工艺条件下连翘叶总三萜提取试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果

2.2.2 模型的建立及显著性检验 利用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 数据进行多元回归拟合，得到连翘叶总三萜提取率（Y）对乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）的二次多项回归方程为：Y=13.95+1.16A+0.87B+0.91C+0.59D+0.60AB+ 0.54AC- 0.22AD+ 0.002 5BC+ 0.33BD-0.078CD-1.27A2-1.59B2-1.94C2-1.68D2。对该模型进行方差分析，结果见表3。该试验所建模型极显著（P<0.000 1）；模型失拟项P=0.320 3>0.05，表明失拟不显著。方差分析结果得出决定系数R2和校正决定系数RAdj2分别为0.960 5 和0.921 1，说明该模型预测性能良好，因此用该模型分析和预测连翘叶中总三萜的提取率是合适的。

表3 方差分析结果

方差分析结果表明，回归模型的一次项A、B、C、D极显著（P<0.01）；交互项AB显著（P<0.05）；二次项A2、B2、C2、D2极显著（P<0.01）；其余均不显著。影响连翘叶总三萜提取率的因素表现为A>C>B>D，即乙醇浓度>提取时间>料液比>提取温度。

2.2.3 提取工艺的响应面交互作用分析 为了更直观地反映出两两因素交互作用对连翘叶总三萜提取率效果的影响，在其他因素不变的情况下，选取2 个交互因素对连翘叶总三萜提取率进行响应面分析，利用Design-Expert 8.0.6 软件绘制响应面3D 图（图5）。由图5 可以看出，乙醇浓度（A）和料液比（B）的交互作用对响应值Y的影响显著（P＜0.05），在提取时间和提取温度一定的情况下，Y随着因素A和B的增加而增大。乙醇浓度（A）和提取时间（C）、乙醇浓度（A）和提取温度（D）、料液比（B）和提取时间（C）、料液比（B）和提取温度（D）、提取时间（C）和提取温度（D）的交互作用均不显著，具体表现为两两因素交互作用的响应面坡度变化缓慢。

综合回归模型的分析可知，连翘叶总三萜最优提取工艺参数为乙醇浓度85%、料液比1∶37.96 g/mL，提取时间35.39 min、提取温度57.74 ℃。为方便实际操作，设定最优提取工艺参数为乙醇浓度85%、料液比1∶40 g/mL、提取时间35 min、提取温度60 ℃。在此条件下平行操作5 次，实际测得总三萜的平均提取率为14.13%，与模型理论预测值14.25%基本吻合。

2.3 连翘叶总三萜纯化结果

经树脂富集纯化后连翘叶中总三萜的纯度结果见表4，可见纯化效果较好的多为非极性树脂，如D-101、D3520 和D4020 型大孔树脂等，其中D101 型大孔树脂的纯化效果最好，可获得纯度为72.89%的连翘叶总三萜产品，纯度约为纯化前的5.16 倍，故最终确定连翘叶总三萜纯化用最佳树脂为D-101，并测定其熊果酸、齐墩果酸和白桦脂酸的含量。HPLC法测定连翘叶总三萜中熊果酸、齐墩果酸和白桦脂酸的含量分别为70.11%、14.23%和4.79%，HPLC 图谱如图6 所示。

图6 连翘叶总三萜HPLC 图谱

表4 不同大孔树脂对连翘叶总三萜纯化的结果

2.4 连翘叶总三萜抗肿瘤活性研究

由表5 可知，连翘叶总三萜纯化样品对人乳腺癌细胞、肝癌细胞和结肠癌细胞均具有一定的增殖抑制作用，其中对乳腺癌细胞和肝癌细胞的增殖抑制作用比较明显，对乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 的IC50分 别 为（6.29±0.34）mg/L 和（9.51±0.71）mg/L，对肝癌细胞HepG2 和SNU-739 的IC50分别为（12.05±1.23）mg/L 和（9.91±0.94）mg/L；而且与阳性对照药米托蒽醌相比，该化合物对正常肝细胞HL-7702 的影响明显弱于肿瘤细胞，IC50大于100 mg/L。

表5 连翘叶总三萜纯化样品对7 种肿瘤细胞的IC50 （单位：mg/L）

3 小结

采用超声技术提取连翘叶总三萜，通过响应面法优化得到最优提取工艺为乙醇浓度85%，料液比1∶40 g/mL，提取时间35 min，提取温度60 ℃，此条件下得到连翘叶总三萜的提取率为14.13%，基本与理论值相符合，说明响应面法优化得到的提取工艺具有一定的参考价值。6种树脂中D101型树脂为最佳，经纯化后的连翘叶总三萜的纯度达72.89%，HPLC法测定纯化后的连翘叶总三萜中熊果酸、齐墩果酸和白桦脂酸的含量分别为70.11%、14.23%和4.79%。

近年来，随着人类对天然药物越来越关注，从天然药物中获取抗肿瘤有效成分已成为肿瘤防治的研究热点［16-20］。本研究体外抗肿瘤试验结果表明，连翘叶总三萜对人乳腺癌、肝癌和结肠癌等6 种肿瘤细胞均具有良好的增殖抑制效果，应用前景十分广阔，具有很高的社会意义和商业价值。