石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的制备及质量评价

陈惠欣，臧远龙，林淑琪，吕宪东，崔红静，侯 磊，王京龙

（枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160）

石榴籽为石榴科石榴（Punica granatumL.）的种子，石榴籽具有抗氧化［1］、抗炎［2］、抗肿瘤［3］、降血糖［4］、降血脂［5］、保护心血管［6］等作用。石榴籽油是一种十分有益于人体的天然ω-3 系油，含量占石榴籽的13%~23%［7］，能抵抗人体炎症和氧自由基的破坏，有延缓衰老、预防动脉粥样硬化和减缓癌变进程的作用［8］。石榴籽提取物具有一定的雌性激素作用，在临床上用于妇女更年期疾病的治疗，对由于摘除卵巢引起的骨质翻转有一定抑制作用［9］。而且有研究表明，石榴籽油对人类乳腺癌细胞和皮肤癌均有一定的预防和治疗作用［10］。大豆异黄酮具有雌激素样作用［11］，能明显地预防和治疗心血管疾病［12］、提高大脑抗氧化能力［13］、降低人体多种雌激素依赖型疾病的发病率［14］。

目前，市场上大豆异黄酮软胶囊多以大豆油作为基质，本研究设计石榴籽油代替大豆油，与大豆异黄酮复配，优化软胶囊内容物的处方，使其既能发挥介质的分散作用，又能够发挥雌性激素样作用，改善身体机能，缓解女性更年期综合症。同时，本研究以废弃的石榴籽为原料，不仅有利于石榴籽油的综合利用，还能为抗更年期药物的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆异黄酮干浸膏粉（食用级，批号20171018），购于郑州万搏化工产品有限公司；石榴籽油（食用级），购于深圳帝纬嘉生物科技有限公司；蜂蜡（批号060114006037）、大豆卵磷脂（磷脂含量95%，批号060099001074）、轻质液体石蜡（批号059405009100），均购于山东优索化工科技有限公司；明胶（食用级）、甘油（药用级），均购于北京中天精蓝科技有限公司；大豆苷（批号BZP0007）、复配着色剂（牛奶巧克力棕，批号20171223），购于合肥博美生物科技有限责任公司；二氧化钛（白色素，批号20160415），购于上海江沪钛白化工制品有限公司。乙腈、冰醋酸为色谱纯，石油醚、无水乙醇为分析纯，水为自制去离子水。

1.2 仪器

1260 系列高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；DSH-50-5 型水分快速测定仪，上海越平科学仪器有限公司；UV-2600 型全波段紫外可见扫描仪，岛津仪器有限公司；KS-300EI 型超声波清洗机，宁波海曙科生超声设备有限公司；JLG-60 型真空搅拌器，北京中天精蓝科技有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；JLR 系列50 型软胶囊机，北京中天精蓝科技有限公司；PZ-D-5 型液体比重天平，上海越平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 软胶囊内容物制备 取干燥保存的大豆异黄酮干浸膏粉，充分研磨过100 目筛，备用。在软胶囊类产品研发过程中，对软胶囊内容物成分的选择十分重要。为了保证大规模生产，作为软胶囊混悬介质的辅料与药物混合必须具有良好的流动性才能达标，同时混合液也必须具备良好的物理稳定性［15］，综合多方面因素进行考察。植物油为软胶囊中最常用的基质，石榴籽油含有不饱和共轭脂肪酸，还富含抗氧化因子，具有很强的清除人体自由基和延缓衰老的能力。选用石榴籽油代替大豆油作为基质，还可以废物资源化，因此本次试验将软胶囊基质确定为石榴籽油。

石榴籽油用量选择。根据保健品规定及参考市场常见大豆异黄酮软胶囊规格，将软胶囊大小确定为500 mg/粒，主药大豆异黄酮干浸膏粉含量25 mg/粒，其余基质含量为475 mg/粒。本试验所购买石榴籽油密度为0.918~0.926 g/mL，通过液体天平测定密度为0.920 g/mL。根据助悬剂蜂蜡与大豆卵磷脂的添加量，确定石榴籽油占比为92%，添加量为460 mg/粒。

助悬剂和润湿剂的选择及用量选择。大豆卵磷脂是软胶囊制备中常用的乳化剂和润湿剂，蜂蜡也为软胶囊中常用的助悬剂，润湿剂与助悬剂的配合可以使软胶囊内容物混悬效果更好。因此选用大豆卵磷脂和蜂蜡作为润湿剂和助悬剂进行试验，考察所得混悬液在（25±2）℃的流动性、切断性和分散性等指标，并以沉降比衡量其混悬性。

选择石榴籽油用量之后，按照不同比例的大豆卵磷脂和蜂蜡加入到石榴籽油中（表1），加热搅拌混匀，再加入研磨过筛后的大豆异黄酮干浸膏粉，再次研磨均匀，比较内容物的状态，观察混悬液的流动性、切断性、沉降比、均匀性、再分散性和气泡情况。

表1 软胶囊内容物添加比例 （单位：%）

根据混悬液的沉降公式（Stock’s 公式），想要提高混悬液的稳定性可以通过减小介质粒径，或增加介质黏度，均可达到减小沉降速度的效果。分别采用流动性、切断性、沉降比、分散性和再分散性5 个指标考察软胶囊内容物的稳定性。

1）流动性。将具塞试管倾斜45°，对比添加不同含量润湿剂和助悬剂试管内溶液的流动速度。

2）切断性。根据提起后液滴的收缩及形态进行打分，如液滴快速收缩表明切断性较好，是长丝状表明切断性较差。具体评价标准如下：液滴很快收缩、无长丝出现，评分为10 分；液滴较快收缩、基本无长丝出现，评分为7~9 分；液滴收缩较慢、有长丝出现，评分为2~6 分；液滴提起后呈明显的长丝状，几乎不收缩，评分为1 分。

3）沉降比。将已配好的石榴籽油大豆异黄酮软胶囊内容物置具塞式试管中，量取液面高度H1，在室温下静置24 h 后油固分层，测量混悬液固体层高度H2。沉降比＝H2/H1×100%。

4）分散性。用肉眼对光观察软胶囊内容物的状态，检测混合物混悬是否均匀，有无结块或气泡，对其进行评价。

5）再分散性。对放置3 d 已经分层的软胶囊内容物，将具塞试管颠倒数次直至混匀至初试混悬状态，对比颠倒次数。

1.3.2 软胶囊的制备 根据上述试验结果拟定软胶囊配方（按1 000 粒量）为大豆异黄酮浸膏粉25 g、石榴籽油460 g、蜂蜡10 g、大豆卵磷脂5 g。取石榴籽油、蜂蜡、大豆卵磷脂混匀，加热至约65 ℃使蜂蜡和大豆卵磷脂完全融化到石榴籽油中，搅拌冷却至30 ℃左右，加入过筛的大豆异黄酮干浸膏粉，搅拌均匀，研钵充分研磨。静置，45 ℃保温除气泡，备用。

将囊壳配比确定为明胶∶甘油∶水∶白色素∶牛奶巧克力棕着色剂=1.00∶0.35∶1.00∶0.05∶0.60。预先将真空搅拌器水浴夹层温度设为90 ℃，加入定量的纯净水，随后加入白色素与牛奶巧克力棕着色剂，搅拌均匀。待真空搅拌器内温度达85 ℃时，按甘油、明胶顺序加入真空搅拌器，搅拌使其熔融成均匀胶液，控制时间为1 h。后将真空搅拌器水浴夹层温度调至55~60 ℃，静置保温12 h，备用。

软胶囊内容物和囊壳胶液制备完成后，采用压制法制备软胶囊。具体步骤如下。

1）压丸。通过压力泵加压将真空搅拌器内已配好的料液输送到软胶囊机料液槽中，在环境温度18~20 ℃，空气相对湿度30%，内容物温度小于40 ℃，喷体温度40 ℃左右，料液槽提前预热到60 ℃左右，控制胶皮厚度0.8~0.9 mm 条件下，压制成软胶囊。

2）定型干燥。将已压制成的软胶囊收取平整排放，在空气相对湿度20%~30%、干燥温度30~35 ℃条件下的转笼里鼓风干燥4 h。

3）洗丸。软胶囊生产过程中经常使用医用石蜡油作为润滑剂，因此常在胶囊外壳黏带喷洒一些医药用级别石蜡，使用食品级无水乙醇或95%的乙醇溶液泡洗10 余秒除去囊壳表面的石蜡，洗完后进行干燥。

4）干燥、捡丸。在温度20~25 ℃，空气相对湿度20%条件下的干燥间进行干燥。将分别干燥24、36、48 h 后的软胶囊用无水乙醇洗净后，石油醚清理内容物，风干后，检测囊壳的含水量分别为12.00%、7.21%、4.89%，参考朱孟夏等［16］的研究，含水量低于9%即可，但考虑到工厂生产需要快速运行，因此选取干燥时间为36 h。干燥后，挑出干瘪、变形、漏液或有可见杂质等不合格的胶囊。最后使用干净塑料瓶装收软胶囊，规格为30 粒/瓶。

1.3.3 总异黄酮含量的测定

1）对照品溶液的制备。精密称取大豆苷对照品5 mg 于10 mL 容量瓶中，无水乙醇溶解定容至刻度，作为大豆苷对照品母液（0.5 mg/mL）。精密量取大豆苷对照品母液240 μL 于10 mL 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，配制成12 μg/mL 待测对照品溶液，备用。

2）供试品溶液制备。随机选取合格软胶囊，进行称量，记录g1。将软胶囊于干净烧杯中剪破，20 mL 石油醚洗净囊壳，保留石油醚相。将挥发除去残留石油醚的囊壳称量，记录g2。将石油醚相震荡5 min 除脂，过滤。将滤饼用20 mL 60%乙醇溶液超声15 min 溶解，过滤，60%乙醇溶液定容至250 mL 容量瓶刻度线，得供试品溶液。

3）全波长扫描。利用全波段紫外可见扫描仪，1 cm 石英比色皿，在标准空白溶液调零后，将对照品溶液、供试品溶液在200~400 nm 波长范围进行全波长扫描，结果发现265 nm 为最大吸收波长。

4）标准曲线绘制。精密称取大豆苷5 mg，用无水乙醇溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得浓度为0.5 mg/mL 的标准贮备液，分别吸取0、40、80、120、160、200 μL 标准贮备液于10 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至10 mL 刻度线，该梯度溶液的浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg/mL。利用UV-2600 型全波段紫外可见扫描仪，选择265 nm 为检测波长，在空白溶液调零后，对0、2、4、6、8、10 μg/mL 的标准梯度溶液进行波长检测，以吸光度-浓度绘制标准工作曲线，得线性方程：y=0.061 8x＋0.001 6，r2=0.999 2。结果表明大豆苷在2~10 μg/mL 浓度范围内线性良好。

5）精密度试验。分别精密吸取6 份对照品母液（0.5 mg/mL）120 μL 于10 mL 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度线，在265 nm 处检测吸光度，计算吸光度平均值为0.414 5，RSD为0.73%，结果表明仪器精密度良好。

6）重复性试验。分别精密吸取6 份供试品溶液1.6 mL 于10 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，测定吸光度。计算平均浓度为0.75 μg/mg，RSD为0.66%，结果表明方法重现性良好。

7）稳定性试验。分别精密吸取供试品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，每隔1 h 测定供试液的吸光度，计算出吸光度平均值为0.494，RSD为0.28%。试验结果表明在5 h 内测定稳定。

8）加样回收率试验。分别精密吸取6 份大豆异黄酮供试品溶液1.6 mL 于10 mL 容量瓶中，各加入大豆苷对照品母液80 μL，测定吸光度。平均回收率为99.2%，RSD为2.67%，结果表明试验方法稳定可行。

9）含量测定。取供试品溶液3 份，按照标准曲线项下方法进行测定，计算软胶囊中总异黄酮的含量。

1.3.4 大豆苷含量的测定

1）色谱条件。HPLC 色谱参考条件如下。

色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%乙酸水溶液（A）—0.1%乙酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱（0~12.5 min，10%B；12.5~17.5 min，30%B；17.5~18.5 min，40%B；18.5~21.0 min，100%B；21.0~22.5 min，100%B；22.5~26.0 min，100%B）；流速：1 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2）对照品溶液的制备。精密量取大豆苷5 mg，无水乙醇超声5 min 溶解，定容至10 mL 容量瓶中，得0.5 mg/mL 的大豆苷对照品溶液，备用。

3）大豆苷标准曲线的制备。分别精密吸取0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mL 的大豆苷母液于25 mL容量瓶中，60%乙醇溶液定容至刻度线，得0、0.02、0.05、1.00、2.00、4.00 μg/mL 的大豆苷标准曲线溶液。大豆苷液相色谱标准曲线的回归方程为：y＝78.446 0x-0.373 1，r2＝0.999 8。结果表明大豆苷在0.4~8.0 μg/mL 之间线性良好。

4）供试品溶液的制备。见“1.3.3”项下供试品溶液的制备，得大豆苷测定的供试品溶液。

5）精密度试验。取4 μg/mL 大豆苷对照品溶液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，进样量为20 μL，重复进样6 次，测定峰面积，计算RSD为1.27%。结果表明方法精密度良好。

6）重复性试验。取供试品溶液，按照“1.3.3”方法测定，平均浓度为3.98 μg/mL，RSD为4.2%。

7）稳定性试验。取供试品溶液，间隔1 h 进样，分别在0、1、2、3、4、5、6 h 测得峰面积，计算RSD为1.27%。结果表明，供试品溶液在6 h内稳定性良好。

8）加样回收试验。取重复性试验项下的溶液5 mL 于10 mL 容量瓶中，用8 μg/mL 对照品溶液定容至刻度线。测定峰面积，计算平均回收率为102.5%，RSD为0.97%。

9）含量测定。取供试品溶液3 份，按照标准曲线项下方法进行测定，计算软胶囊中大豆苷的含量。

1.3.5 通则检查 对石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的质量通则评价参考2020 年版《中华人民共和国药典》“制剂通则”项下对胶囊剂的要求。

1）水分。因《中华人民共和国药典》未对软胶囊的囊壳水分有明确规定，本试验参考朱孟夏等［16］对复方鸦胆子油软胶囊的研究方法。

2）装量差异。随机抽取3 个批次的石榴籽油大豆异黄酮软胶囊，每批10 粒，分别精密称定，将软胶囊剪切开，清除内容物，石油醚洗净囊壳，挥发除去囊壳上残留的石油醚，再分别称定囊壳重量，测得胶囊装量重。

3）崩解时限。随机选取3 个批次石榴籽油大豆异黄酮软胶囊，每批次6 粒，进行崩解试验。

4）性状评价。石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的感官指标可用肉眼对光观察。

2 结果与分析

2.1 软胶囊内容物各成分占比

按照“1.3.1”项下方法进行试验，考察软胶囊内容物的最佳比例。将大豆异黄酮粉加入混匀溶解的基质中，研磨均匀后，直接倒入具塞试管静置24 h 后记录现象，结果见表2。将静置24 h 后的内容物摇匀排除气泡后，再静置24 h，试验现象及结果见表3。

表2 研磨混合后24 h 直接观察情况

表3 摇匀除气泡后24 h 观察情况

由表2、表3 可知，保持软胶囊内容物中蜂蜡含量不变，随着大豆卵磷脂含量的增多，伴有的气泡含量也增多，且药物分布不均匀概率增大。保持大豆卵磷脂含量不变，随着蜂蜡含量增加，药物流动性和切断性变差，且出现黏壁现象。

综上所述，试验A 中药液流动性好，药物分布均匀，再分散性好，沉降比较高且气泡干扰少。确定将软胶囊内容物中助悬剂和润湿剂成分确定为大豆卵磷脂1%、蜂蜡2%、石榴籽油92%、大豆异黄酮干浸膏粉5%。

2.2 含量测定结果

按照“1.3.3”“1.3.4”项下方法，分别测定软胶囊中总异黄酮和大豆苷含量，测定结果见表4。本研究建立的软胶囊中总异黄酮、大豆苷含量测定精密度、稳定性、重复性等方法学考察均符合要求，含量测定相对标准偏差较小，稳定性高，质量可控。

表4 石榴籽油大豆异黄酮软胶囊中总异黄酮、大豆苷含量测定结果 （单位：mg/粒）

2.3 通则检查结果

软胶囊囊壳呈黑褐色，无异味，外观完整，干净光洁，无变形、黏结等现象，内容物为棕黄色油状混悬物，软胶囊内无肉眼可见的外来杂质；所测软胶囊内水分含量小于9.0%；装量差异在±10%；平均崩解时间为25.83 min。

结果显示，石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的质量通则评价符合2020 年版《中国药典》“制剂通则”项下对胶囊剂的要求。

3 小结与讨论

石榴籽油中富含脂肪酸，不饱和脂肪酸占95.67%。以石榴酸为代表的不饱和脂肪酸能抵抗人体氧自由基和炎症的破坏，有延缓衰老、预防动脉粥样硬化和减缓癌变进程等作用［17］。本试验创新选择石榴籽油作为软胶囊的基质，将石榴籽油和大豆异黄酮复方配伍，协同发挥抗衰老作用。

本研究优化得到了石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的生产工艺参数：石榴籽油为分散介质占92%、大豆卵磷脂为润湿剂占1%、蜂蜡为助悬剂占2%、大豆异黄酮干浸膏粉占5%；囊壳配比为明胶∶甘油∶水∶白色素∶牛奶巧克力棕着色剂=1.00∶0.35∶1.00∶0.05∶0.60。室温干燥时间为36 h，可使水分含量小于9%，装量差异符合规定。

软胶囊30 粒/瓶，根据生产要求，推荐软胶囊的规格为500 mg/粒，大豆苷含量1.00 mg/粒，总异黄酮含量3.73 mg/粒。通过试验研究和小试生产，所得软胶囊工艺稳定，质量可控，为石榴籽油大豆异黄酮软胶囊的产业化生产提供了依据。