高功率脉冲微波协同花色苷对大豆分离蛋白理化特性的影响及其在蛋糕中的应用

吴 寒，刘浩男,2，邸清茹,3，夏依旦·买买提，刘小莉,2,3,*，周剑忠,2,*

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；3.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

大豆分离蛋白（soybean protein isolates，SPI）是优质蛋白质的主要来源，成本低廉，具有很高的营养价值，利于消化，且不含胆固醇，常作为食品配料广泛应用于食品工业[1]。SPI按离心沉降速率可分为2S（20%）、7S（40%）、11S（30%）、15S（10%），其中7S和11S是主要成分。随着人们对多功能活性蛋白质需求的增长，越来越多的研究开始关注如何赋予SPI更高的生理活性。通过化学结构修饰从而使SPI的理化特性改变是目前常用的研究手段，主要包括物理场改性、非共价互作改性、糖基化改性和多种方式结合的改性[2]。

近年来，利用多酚与蛋白相互作用改善蛋白质的功能特性已成为研究热点。蓝莓花色苷（blackberry anthocyanins，BANs）是一种多酚类物质，具有丰富的生物学活性，例如抗氧化、提高免疫系统、抑菌活性等[3]。BANs与SPI相互作用能够增强SPI的功能活性，具有广阔的应用前景。研究表明，除了温度、pH值、离子浓度等外部因素会影响花色苷与蛋白相互作用，一些物理加工技术，如超声、高压、脉冲电场等，也可以通过改变蛋白质结构与功能影响花色苷与蛋白的相互结合。Wang Yilun等[4]利用超声处理SPI-山楂黄酮复合物，结果表明超声可以有效减少复合物的α-螺旋和无规卷曲结构含量，增加β-转角和β-折叠结构含量，使蛋白质荧光猝灭增强。张铁华[5]研究发现，高压脉冲电场处理时，合适的脉冲强度能够有效改善蛋白质的起泡性和乳化性，但是随着脉冲强度的升高，蛋白逐渐发生聚集，导致其溶解性降低。

高功率脉冲微波（high power pulse microwave，HPPM）作为一种新型的食品加工技术，可通过将高压脉冲加在磁控管上产生周期性高频脉冲微波从而作用于样品[6]，具有平均功率低、耗能小、效率高、瞬时高能和间歇作用的特点[7]。由于HPPM兼具电磁脉冲和微波的相关特点，并且瞬时功率较高，还可对生物系统产生一定效应[8]。吕士杰等[9]的研究表明，HPPM辐射可造成动物体海马组织结构改变。Patel等[10]采用新型脉冲微波-真空组合技术开发了一种山药加速渗透脱水的工艺。张亚新等[6]利用气调包装协同HPPM处理蟹肉，可以有效延长蟹肉贮藏期。然而，HPPM协同花色苷对蛋白质进行修饰从而影响大豆蛋白功能特性的研究尚鲜见报道。

本研究主要利用HPPM物理场作为强化传质的手段，研究其对BANs改性SPI方面所发挥的作用，一方面探究HPPM对SPI-BANs复合物加工特性和功能活性的影响；另一方面，进一步明确新型大豆蛋白配料——高功率脉冲微波-大豆分离蛋白-花色苷（HPPM-SPI-BANs）复合物在戚风蛋糕中的应用效果，为深入探讨物理场协同改性大分子蛋白的作用机制提供一定的理论参考，同时为扩大HPPM在食品领域的应用范围提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI（食品级，纯度90.56%） 河南林邦生物科技公司；花色苷（纯度54%）由实验室从黑莓果实中提取纯化所得；鸡蛋、低筋面粉、白砂糖、玉米油、纯牛奶南京苏果社区超市；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，D P P H）、三吡啶基三嗪 美国S i g m a 公司；柠檬酸、柠檬酸钠、硫酸亚铁、氯化铁 国药控股化学试剂有限公司；所有有机溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HPPM杀菌机由江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程创新团队与南京翀电科技有限公司联合研制；Epoch 2酶标仪 美国Bio-Tek公司；PB-10酸度计德国Sartorius科学仪器有限公司；K35FK602烤箱 浙江苏泊尔有限公司；TMS-Touch质构仪 美国FTC公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs复合物制备

根据前期实验的优化结果，将SPI溶于0.1 mol/L pH 6.0柠檬酸缓冲液中，终质量浓度为0.5 mg/mL，将BANs溶于0.1 mol/L pH 3.0柠檬酸缓冲液中，以质量比1∶1混合SPI与BANs，室温下避光搅拌12 h，得到SPIBANs复合物。之后在脉冲功率750 kW、脉冲宽度1.5 μs条件下，选择脉冲频率60 Hz处理15 min，得到HPPMSPI-BANs复合物。

1.3.2 溶解性测定

依据江连洲[11]和Meng Yueyue[12]等的方法修改后进行溶解性的测定，将SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs溶液在10 000×g条件下离心20 min，适当稀释离心前SPIBANs溶液和稀释后收集的上清液，采用考马斯亮蓝法[13]测定蛋白质量浓度。按公式（1）计算溶解性。

式中：ρsp为离心后上清液蛋白质量浓度/（mg/mL）；ρtp为离心前样液总蛋白质量浓度/（mg/mL）。

1.3.3 起泡性和泡沫稳定性测定

起泡性和泡沫稳定性参照Sui Xiaonan等[14]的方法进行测定。将冻干后的SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs分别配成10 mg/mL溶液，依次记录体积。之后，将SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs溶液均质1 min，记录样品泡沫的最初体积，静置15 min后，再次记录泡沫体积。按公式（2）、（3）分别计算起泡性和泡沫稳定性。

式中：V0为样品体积/mL；V0为最初泡沫体积/mL；V15为静置15 min后泡沫体积/mL。

1.3.4 乳化性和乳化稳定性测定

乳化性和乳化稳定性依据Malik等[15]的方法进行测定。分别将冻干的SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs配成10 mg/mL溶液，与菜籽油以3∶1（V/V）比例混合，各均质1 min，吸取其底部乳液50 μL，加入质量分数0.1%十二烷基硫酸钠溶液稀释250 倍，混合均匀，测定500 nm波长处吸光度，静置30 min后再次测定吸光度，空白对照为十二烷基硫酸钠溶液。按公式（4）和公式（5）分别计算乳化性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）。

式中：N为稀释倍数；ρ为样液蛋白质量浓度/（g/mL）；V为乳化液中油相体积分数/%；A0为最初乳液吸光度；A30为静置30 min后乳液吸光度。

1.3.5 戚风蛋糕制作工艺

根据预实验，以综合感官评分为指标，优化得到制作工艺。混合蛋黄60 g、牛奶30 g、玉米油40 g和白砂糖10 g，加入低筋面粉65 g和泡打粉5 g，搅拌制成蛋糊。在蛋清液中替换10%（以蛋清液体系体积计）HPPM-SPIBANs溶液，将获得的蛋清蛋白溶液225 g与白砂糖50 g混匀，快速打发蛋白膏使其呈峰状。将蛋白膏倒入蛋糊，搅拌成蛋糕糊。烤箱温度先调至130 ℃，烘烤80 min，再调至150 ℃，烘烤20 min，蛋糕倒扣冷却，脱模。添加HPPM-SPI-BANs的蛋糕标记为C-HSB，仅添加蛋清和SPI的蛋糕分别标记为C-E和C-S。

1.3.6 焙烤损失率和含水率测定

通过测定蛋糕糊的质量和焙烤后蛋糕的质量，按公式（6）计算蛋糕的焙烤损失率。

式中：ms为蛋糕糊质量/g；mc为焙烤后蛋糕质量/g。

待蛋糕出炉，冷却至室温。参照GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[16]的方法测定含水率。

1.3.7 质构特性分析

新鲜蛋糕切成2 cm×4 cm×4 cm均匀方块，确保表面和底面平整，使用配备P/36R探头的质构分析仪进行测试。测试速率120 mm/min、形变量50%，保持时间3s。

1.3.8 抗氧化能力测定

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性测定

DPPH自由基清除率根据Dai Yiqiang等[17]的方法测定，并稍作修改。将冻干后的SPI、SPI-BANs和HPPMSPI-BANs分别配成10 mg/mL溶液，作为样液待用；C-HSB、C-S和C-E经过干燥粉碎，以体积比1∶10加入体积分数75%醇溶液提取2 h，8 000 r/min离心10 min，收集上清液待用。吸取100 μL样液，与100 μL 0.4 mmol/L DPPH溶液混匀，室温下暗反应30 min，测定517 nm波长处吸光度，空白对照用pH 6.0的柠檬酸缓冲液替代样液。按公式（7）计算DPPH自由基清除率。

式中：As为样液反应后吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.8.2 铁离子还原力测定

铁离子还原力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）根据Chen Gang等[18]报道的方法进行测定。混合100 mL 0.3 mol/L pH 3.6醋酸缓冲液、10 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20 mmol/L氯化铁溶液，制备FRAP试剂。取1.3.8.1节100 μL样液与500 μL FRAP试剂混合均匀，37 ℃水浴反应10 min，测定593 nm波长处吸光度，用pH 6.0柠檬酸缓冲液代替样品作空白对照，以不同浓度FeSO4溶液代替样品绘制得到标准曲线。FRAP用FeSO4当量表示。

1.3.9 老化速率测定

根据唐梦琪[19]报道的方法稍作修改，测定老化速率。将制备得到的蛋糕放于室温，贮藏第0、1、2、3天时分别测定硬度，采用Avrami方程（公式（8））对老化速率进行计算与分析。

式中：指数n代表有关晶核特性及晶体生长过程的信息；k表示成核与晶体成长速度的复合作用；R表示淀粉的老化度，其可用硬度F代替。改写后的Avrami方程如公式（9）所示，等式两边取对数可得公式（10）。

式中：F0为烘烤后蛋糕硬度；Ft为储藏t天时蛋糕硬度；F∞为蛋糕的极限老化硬度；n为Avrami指数；k为蛋糕老化速率。

将在室温条件分别储藏0、1、2、3 d的蛋糕硬度分别代入Avrami方程，根据公式（9）计算得到第t天的老化度，对lnt进行线性回归分析，得到老化速率k和Avrami指数n。

1.4 数据处理与分析

所有数据均为3 次重复实验所得，结果以平均值±标准差表示，应用SPSS Statistics 26软件对结果进行显著性分析（单因素方差分析法和Duncan法）和相关性分析（Pearson法），以P＜0.05表示差异显著，采用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 HPPM协同花色苷对SPI溶解性的影响

溶解性是蛋白质在食品体系中发挥功能的先决条件，通常受到氨基酸组成和序列、pH值及多糖和其他化合物（如多酚）的影响。如图1所示，SPI溶解性为42.44%，这与Deak等[20]所报道的SPI溶解性为42.62%的结果接近。与对照SPI相比，添加花色苷后，SPI-BANs复合物的溶解性显著增加了0.39 倍（P＜0.05），这可能是花色苷与大豆蛋白相互作用，使蛋白质结构改变，多肽链展开，疏水基团暴露所造成的。Ozdal[21]和Cao Yanyun[22]等也发现，随着蛋白质与酚类化合物的结合，蛋白质疏水基团虽有所暴露，但随着多酚浓度增加，表面疏水性降低，蛋白电荷发生改变，从而影响了蛋白质的溶解性。此外，在HPPM处理条件下，HPPM-SPI-BANs复合物的溶解性提高了1.11 倍，这与Chen Gang等[18]的研究结果相一致，超高压等非热加工技术也可以提高蛋白质-多酚复合物的溶解性，表明物理场处理可能破坏蛋白质的二级结构，使β-折叠和α-螺旋发生改变，此时水分子更易进入蛋白质内部与其分子发生水和作用，提高了蛋白质的溶解性。

图1 不同处理方式下SPI的溶解性Fig.1 Effects of different treatments on solubility of SPI

2.2 HPPM波协同花色苷对SPI功能特性的影响

2.2.1 HPPM波协同花色苷对SPI起泡性及泡沫稳定性的影响

基于在空气-水界面的快速扩散和结构展开，蛋白质表面张力下降，产生发泡行为[22]，然而，空间构象和表面电荷密度能够改变SPI的二级和三级结构，影响蛋白质的起泡功能[23]。如图2所示，SPI-BANs复合物的泡沫稳定性显著高于SPI（P＜0.05），这可能与蛋白质和花色苷互作后蛋白结构改变有关。Ye Jiangping等[24]的研究也发现了类似现象，芦丁-SPI复合物比单独SPI具有更高的发泡能力和泡沫稳定性。此外，HPPM-SPIBANs的起泡性和泡沫稳定性均显著高于SPI和SPI-BANs（P＜0.05），高功率脉冲微波处理可能使得蛋白质结构柔韧性增强，具有更低的表面张力，复合物可在空气-液体界面形成更多弹性气泡，吸附在气-水界面上，说明HPPM处理协同花色苷能够更有效地改善SPI的起泡功能。

图2 不同处理方式下SPI的起泡能力Fig.2 Effects of different treatments on foaming capacity of SPI

2.2.2 HPPM波协同花色苷对SPI乳化性及乳化稳定性的影响

通常，蛋白质的乳化能力可以归因于以下两个方面：一是蛋白在油滴周围迅速扩散到油-水界面形成界面膜的能力；二是蛋白通过部分展开和重新排列界面，使界面张力降低、乳液稳定和防止絮凝或聚结的能力[25]。图3所示为SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs的乳化性和乳化稳定性分析结果。相同质量浓度下，SPI-BANs的EAI和ESI均显著高于SPI（P＜0.05），这可能是蛋白质与花色苷结合使蛋白质结构改变，液滴间空间斥力增加和表面电荷变化所致。类似地，Zhang Shu等[26]通过荧光光谱学分析明确了添加适当多酚可以使绿豆球蛋白α-螺旋、β-折叠和β-转角比例增加，无规卷曲比例减少，提高蛋白质的EAI。对于HPPM-SPI-BANs，其EAI和ESI则显著高于SPI-BANs，表明HPPM处理能使蛋白质的结构舒展，链节变得更为柔顺，有利于在界面上进行分子有序重排，同时增强蛋白质与花色苷的分子间作用力，提高蛋白质的亲水亲油性和乳化能力。

图3 不同处理方式下SPI的乳化能力Fig.3 Effects of different treatments on emulsifying capacity of SPI

2.3 HPPM波协同花色苷对SPI抗氧化活性的影响

对SPI、SPI-BANs和HPPM-SPI-BANs三者的抗氧化能力进行热图分析，结果如图4所示。热图中颜色的深浅表示样品抗氧化能力的强弱，其中，SPI几乎不具备抗氧化能力，在DPPH清除自由基能力方面，HPPM-SPIBANs的清除能力明显高于SPI和SPI-BANs，且SPI-BANs也明显高于SPI（P＜0.05）。铁离子还原能力在3 种样品中的变化趋势与DPPH自由基清除能力基本一致。由此可见，复合物抗氧化能力的增强主要来源于花色苷的作用，其抗氧化活性较强，通过与蛋白质相互结合可以赋予SPI更高的功能活性[3]。此外，HPPM-SPI-BANs的抗氧化活性均明显高于SPI-BANs，这是因为HPPM等物理场可有效促进SPI与BANs结合，提高复合物中花色苷结合率，同时使蛋白质中掩埋的还原性基团更多地暴露，从而更大程度上增强复合物的抗氧化活性[4]。综上，通过HPPM协同BANs处理SPI，能够更有效地赋予SPI生理活性方面的功能，制备得到的复合物HPPM-SPI-BANs也可作为新型蛋白配料应用于食品工业中，以强化产品的抗氧化活性。

图4 不同处理方式下SPI的体外抗氧化能力Fig.4 Effects of different treatments on antioxidant capacities of SPI

2.4 HPPM-SPI-BANs对蛋糕烘焙特性的影响

由于烘烤后蛋糕的大部分损失来源于水分，常用烘焙损失率评判蛋糕烘烤前后的质量变化，直观地反映蛋糕制备过程中水分的散发情况，并且焙烤损失率直接影响着产品的经济效益[19]。由表1可知，添加HPPM-SPIBANs对蛋糕的水分散失有显著抑制作用（P＜0.05）。与此同时，戚风蛋糕的正常含水率应在35%～44%之间，最佳含水率应在39%～40%之间[27]，利用具有更高起泡和乳化能力的HPPM-SPI-BANs替代部分蛋清蛋白加入蛋糕中，可使蛋糕的含水率增加至39.25%，处于含水率最佳范围，蛋糕的口感和风味更佳，焙烤损失率由30.14%显著降至26.88%（P＜0.05）。

表1 不同蛋糕的焙烤损失率、含水率和质构特性Table 1 Baking loss rate, moisture content and textural properties of different cakes

质构特性也是衡量蛋糕品质的重要指标，HPPMSPI-BANs对蛋糕质构特性的影响情况如表1所示，包括硬度、内聚性、弹性和咀嚼性。通常，硬度是指使食品发生形变所需要的力，与蛋糕品质呈负相关性，蛋糕越硬口感越差。HPPM-SPI-BANs的添加可使蛋糕内部网孔变大，对力的支撑变弱，显著降低蛋糕硬度（由4.28 N减小至4.12 N（P＜0.05））。对于咀嚼性而言，其也与蛋糕品质呈负相关性，当添加HPPM-SPI-BANs时，蛋糕的咀嚼性显著下降（P＜0.05），口感更加绵软。相比于SPI，HPPM-SPI-BANs的添加还可以显著提高蛋糕的内聚性和弹性，分别由0.56和8.69提高至0.62和10.47（P＜0.05），说明蛋糕内在结合力有所提升，内部质地更加丰富和具有弹性。研究表明，蛋糕的硬度变化与淀粉分子的老化有直接关系[28]；戚风蛋糕的感官品质在一定程度上取决于其硬度与咀嚼性，芯部组织的松软程度与硬度和咀嚼性成反比，与弹性成正比[29]。以上结果表明，添加HPPM-SPI-BANs可以使戚风蛋糕的焙烤损失率、含水率及硬度相比于蛋糕C-E和C-S得到明显改善，且内聚性、弹性和咀嚼性明显优于蛋糕C-S，蛋糕品质得到提升。

2.5 HPPM-SPI-BANs对蛋糕抗氧化活性的影响

由图5可见，添加HPPM-SPI-BANs替代部分蛋清后，蛋糕提取物的抗氧化能力明显高于未添加HPPMSPI-BANs的蛋糕C-E和C-S，其中DPPH自由基清除率分别升高了3.56 倍和1.29 倍。在铁离子还原能力方面，添加HPPM-SPI-BANs的蛋糕分别是蛋糕C-E和C-S的3.79 倍和4.36 倍。新型蛋白配料HPPM-SPI-BANs中因含有活性成分花色苷而具有良好的抗氧化能力，除了能够改善上述对蛋糕烘焙品质外，还赋予了蛋糕较强的功能活性。此前的研究表明，SPI替代部分蛋清加入蛋糕，可以平衡产品的氨基酸水平，提高蛋糕的营养价值[30]，HPPM-SPI-BANs的添加不仅改善了蛋糕口感，还能提升蛋糕附加值，使产品能够满足当下消费市场提出的更高要求。

图5 不同蛋糕体外抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacities of different cakes

2.6 HPPM-SPI-BANs对蛋糕贮藏期品质的影响

2.6.1 HPPM-SPI-BANs对蛋糕水分质量分数和硬度的影响

在贮藏期间，蛋糕水分质量分数和硬度是影响蛋糕品质最直接的指标，也是间接反映蛋糕老化情况的重要指标，随着时间延长，老化后的蛋糕可能口感变差、硬度增加。由于戚风蛋糕属于短保质期烘焙食品，伴随时间的加倍延长会出现菌落生长等对保藏进程不利的影响，因此本实验中设定短时间储藏期，并对不同蛋糕品质进行比较。通过测定蛋糕存放不同时间的水分质量分数和硬度，可以确定HPPM-SPI-BANs对蛋糕贮藏品质的基本影响。从图6A可以看出，添加HPPM-SPI-BANs可以提高蛋糕的水分质量分数，使蛋糕的含水量保持较高的状态，在1～3 d内均高于蛋糕C-E和C-S，这对于防止蛋糕硬度增加有积极作用。如图6B所示，不同蛋糕的硬度在贮藏期内均明显增加，最终达到4.75～5.25 N，并且添加HPPM-SPI-BANs后，蛋糕的硬度变化趋势比蛋糕C-E和C-S有所减缓，始终维持在最低水平，这说明HPPMSPI-BANs可以有效抵抗蛋糕在贮藏过程中存在的淀粉回生等问题，从而改善戚风蛋糕的贮藏品质。夏爽[1]利用超声和糖基化改性大豆蛋白，并将其应用于重油蛋糕中，也改善了蛋糕的货架期品质。计晓曼[27]在蛋清蛋糕中加入酶改性的大豆蛋白，也使产品在储藏期间的质构特性和感官评分均得到提升。

图6 不同蛋糕的贮藏期水分质量分数和硬度变化Fig.6 Changes in water content and hardness of different cakes during storage

2.6.2 HPPM-SPI-BANs对蛋糕老化速率的影响

蛋糕的淀粉老化又称淀粉重结晶，可分为晶体的生成、生长与稳定3 个不同阶段，多用Avrami方程研究淀粉老化的动力学模型[31-32]，明确食物在储藏期淀粉老化规律。由于淀粉老化过程中的结晶具有高分子聚合物结晶的特点，可对蛋糕芯部在储藏期的老化晶核生长模式进行分析，结果如表2所示。在一定温度范围内（-4～35 ℃），Avrami指数n可被分为2 个区间段，晶体生长时的维数和其成核时间决定了该值的大小[33]。当n＜1时，结晶以瞬间成核为主；当1＜n≤2时，结晶以自发成核方式为主[34]。表2中不同蛋糕的n均处于（1,2）区间，说明储藏期蛋糕芯内部发生的支链淀粉重结晶现象主要是自发成核形成的。另外，老化速率常数k则与晶体生长的快慢及晶核密度密切相关，能够提供一系列晶核形成和生长进程的相关信息[33]。添加HPPMSPI-BANs使蛋糕的k值明显减小，仅为0.12，分别小于蛋糕C-E和C-S，表明HPPM-SPI-BANs可以有效减缓蛋糕芯部的老化速度，使其相对不易发生老化。

表2 不同蛋糕储藏期的芯部老化晶核生长模式Table 2 Growth pattern of aging crystal nuclei in core of different cakes during storage

3 结 论

本实验基于SPI与花色苷相互作用，结合了HPPM物理场进行处理，明确了HPPM协同花色苷能够更有效地提高SPI的物理特性（如溶解性、起泡性、泡沫稳定性、乳化性和乳化稳定性），得到的HPPM-SPI-BANs复合物具有更高的抗氧化能力，赋予了SPI可被开发成为新型功能性食品配料的潜力。通过将HPPM-SPI-BANs应用于蛋糕的制作过程，证实了上述复合物能够明显改善戚风蛋糕的质构特性等烘焙特性，提高其功能活性，以及抑制贮藏期内水分散失，延缓蛋糕的老化速率。本研究有利于进一步实现植物蛋白质资源的综合利用，并为后续逐步扩大HPPM等新型非热加工技术的应用范围提供理论和科学依据。