早期运动干预对PD 大鼠模型感觉运动功能的影响

王帅赵刚

（1. 山西警察学院警体部，太原 030401；2. 苏州大学体育学院，江苏 苏州 215031）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种以进行性运动功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。 预计到2030 年，我国PD 患病人数将达494 万，给家庭和社会带来沉重的负担［1］。 因此，寻找能够预防PD 发生或减缓PD 进程的新方法是相关研究关注的热点问题［2－4］。

大量研究证实，运动的神经保护作用可以改善中枢神经系统的功能［5］，促进神经再生［6］。 规律的运动锻炼可明显降低PD 的患病风险［7－9］。 然而PD发病比较隐匿，运动介入方案是保证运动干预效果的重要因素，运动介入时间不同导致运动干预效果存在较大差异［10］。 本研究拟通过单侧注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立PD 模型大鼠，6-OHDA 进入脑组织后可以快速氧化生成超氧自由基，引起DA 合成降低，黑质-纹状体DA 通路功能异常，从而诱导产生与PD 病理状态相类似的运动功能障碍［11－12］，如身体主动运动减少、患侧偏斜、四肢运动平衡障碍及协调性降低等［13－14］。 基于此，探索早期介入运动跑台训练对PD 模型大鼠感觉运动功能和纹状体DA 水平的影响及时间累计效应，为进一步提高PD 的临床运动干预效果提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

96 只6 周龄清洁级健康雄性SD 大鼠，体重230～250 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK（京）2019－0008】，饲养于苏州大学实验动物中心【SYXK（苏）2021－0065】，实验大鼠分笼饲养（3 ～4 只／笼），12／12 h 白昼循环（9：00 ～21：00），自由进食饮水，室温20 ～ 25℃，相对湿度50 ±10%。 适应性喂养3 d，并根据跑台适应性训练结果剔除不能适应运动干预方案的大鼠。 所有动物实验操作均经苏州大学动物伦理委员会审批（SUDA20230522A03）。

1.1.2 主要试剂与仪器

6-羟基多巴胺（氢溴酸盐）（Sigma，H116），羊抗兔IgG／HRP（中杉金桥，ZDR-5306），L-抗坏血酸（sigma，A5960），冷冻切片包埋剂（SAKURA，4583），PBS 缓冲液（中杉金桥，ZLI-9063），Triton X-100（中杉金桥，ZLI-9308），抗TH 抗体（abcam，ab112），DAB kit（中杉金桥，ZLI-9017），阿扑吗啡（Sigma，Y0001465），TBS 液（中杉金桥，ZLI-9073），羊抗兔IgG（H ＋L）（中杉金桥，ZB-2301）。

行为学测试用网格（自制），行为学测试用圆筒（自制），DSPT-202 型动物跑台（段氏，中国），桌面数显脑立体定位仪（瑞沃德，中国），RO-2-10 型超纯水过滤系统（爱思泰克，中国），121-2446 型双垂直电泳仪（六一仪器厂，中国），79-1 型热力搅拌器（荣华仪器厂，中国），HDR-CX12E 型摄像机（Sony，日本）， 10 μL 型微量注射器（Hamilton， 美国），Titramax100 型水平摇床（Heidolph，美国），5417R 型离心机（Eppendor，德国），CM1950 型冰冻切片机（Leica，德国），DP-72 型显微镜（Olympus，日本），MF-5362 型颅骨钻（Silite Corporation，加拿大）。

1.2 方法

1.2.1 PD 大鼠模型的制备与评价

适应性喂养后将大鼠随机分为：对照安静组（SHAM-S；n＝ 24），对照运动组（SHAM-E；n＝24），PD 安静组（PDS；n＝24），PD 运动组（PDE；n＝24）。 依据神经生化指标检测的时间点，在第14天在每组大鼠中随机选取12 只（n＝12）进行免疫组织化学检测，剩余大鼠在第28 天进行免疫组织化学检测（所有实验流程见图1）。

图1 实验流程图Figure 1 Experimental design

大鼠术前禁食24 h，自由饮水，气体麻醉（5%异氟烷，0.8 L／min）。 将动物固定在立体定位仪上，于右侧内侧前脑束［15］（MFB）（AP：－4.3 mm，R： ＋1.5 mm，H：－7.6 ～7.8 mm），以1 μL／min 的速度注射6-OHDA（2 μg／μL）4 μL，完成注射后留针3 ～5 min 后退针并缝合伤口。 对照组注射4 μL 0.9%生理盐水。 术后第14、28 天腹腔注射阿扑吗啡（apomorphine，APO）诱导旋转实验，实验于安静环境中进行，按照0.1 mg／100 g 剂量将APO 溶液注射于大鼠颈部皮下，计数30 min 内旋转次数，结果以向健侧旋转（用逆时针向旋转圈数减去顺时针向旋转圈数） ≥210 r／30 min 者视为成功模型。

1.2.2 跑台训练方案

采用匀速跑台运动［16］（11 m／min，30 min／d，连续每周5 d，共4 周），训练于22：00 ～00：00 进行。运动组于术后24 h 开始运动跑台训练，对于无法进行奔跑的大鼠使用刷子驱赶或适当用手托扶其躯干，以使其完成训练。 在此期间，安静对照组大鼠置于跑台旁侧。

1.2.3 PD 大鼠的感觉运动功能测试

圆筒测试（cylinder test）在手术后第1、4、7、11、14、21、28 天进行，测试环境要求光强度20 Lux、无背景噪音室内，记录大鼠在玻璃圆筒内的活动情况。 根据大鼠触壁情况计算圆筒测试得分＝健侧前肢碰壁次数／前肢碰壁总次数［17］。

网格测试（grid-walking test）在手术后第1、4、7、11、14、21、28 天进行，测试环境要求声音安静、光线昏暗的室内。 将数码摄像机固定于摄像机以置于金属网格下方，记录3 min 内大鼠在网格上的活动情况。 统计指标：（1）四肢滑落次数，滑落行为包括：爪子完全滑落横格、肢体落入网格间、爪子正确的放在横格上，但是当承受身体重量时滑落；（2）总步数；（3）行进格数。

1.2.4 大鼠纹状体酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测

实验第14、28 天运动干预后24 h 内，大鼠气体麻醉（5%异氟烷，0.8 L／min），由心主动脉灌注37℃生理盐水（0.9%）200 mL，灌流结束后迅速取出脑组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定（24 h）。将脑组织取出后脱水后修块、包埋处理，将脑组织按冠状面修整并连续冠状切片，片厚30 μm。 将切好的脑片放在PBS 缓冲液中展开，然后进行染色。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，结果以平均值± 标准差（±s）表示，行为学实验数据各组间的比较采用独立样本t检验。 TH 数据各组间比较采用单因素方差分析，各组内比较采用配对样本t检验，以P＜0.05 表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠右侧纹状体内酪氨酸羟化酶阳性免疫细胞免疫组织化学检测结果

显微镜下选取1 个视野进行观察，SHAM 组大鼠右侧Str 可见大量TH-ir 细胞，胞质呈棕黄色，与此相比，PD 组大鼠右侧Str 内TH 细胞显著减少，透光性增强。 半定量分析结果显示：SHAM-S 组与SHAM-E 组大鼠右侧Str 内TH-ir 细胞数量差异无显著性（P＞0.05）；术后第14、28 天，与SHAM-S 组相比，PDS 组TH 细胞分别减少约70%、80%，且差异均具有显著性（P＜0.05）；术后第14、28 天，与SHAM-E 组相比，PDE 组TH 细胞分别减少约60%、62%，且差异均具有显著性（P＜0.05）；术后第14、28 天，与PDS 组相比，PDE 组TH 细胞存有节余且差异均具有显著性（P＜0.05）（见图2）。 配对样本t检验分析比较PDS 组第14、28 天右侧Str 内TH 细胞数量，发现随着时间的推移TH 细胞数量显著减少（P＜0.05）；而分析比较PDE 组第14、28 天右侧Str 内TH 细胞数量，发现随着时间的推移TH 细胞数量差异不具有显著性（P＞0.05）。

图2 大鼠Str（右侧）TH 阳性细胞占比Figure 2 Str （right） density ratio of TH-ir fibers

2.2 各组大鼠圆筒测试结果

SHAM-S 组与SHAM-E 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的测试得分均无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM-S 组相比，PDS 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的测试得分均显著增加（P＜0.05），有较明显的前肢活动不对称现象存在。 与SHAM-E 组相比，PDE 组在第1、4、7、11、14、21 天的测试得分均显著增加（P＜0.05），有较明显的前肢活动不对称现象存在，但是二者在第28 天的得分无统计学意义（P＞0.05）。 与PDS 组相比，PDE 组在第1、4、7、11、14天的测试得分无统计学意义（P＞0.05），但是PDE组在第21、28 天的得分显著减少（P＜0.05），有较明显的左前肢活动恢复现象存在（见图3）。

图3 圆筒测试得分值比较（ ± s）Figure 3 Comparison of cylinder test scores（ ± s）

2.3 各组大鼠网格测试结果

SHAM-S 组与SHAM-E 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的左侧前肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05）。 与SHAM-S 组相比，PDS 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的左侧前肢滑落次数均显著增加（P＜0.05）。 与SHAM-E 组相比，PDE 组在第1、4、7、11天的左侧前肢滑落次数均显著增加（P＜0.05），但二者在第14、21、28 天的左侧前肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05），PDE 组的左侧前肢滑落次数有明显减少的现象存在。 与PDS 相比，PDE 组在第1、4 天的左侧前肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05），但在第7、11、14、21、28 天的左侧前肢滑落次数均显著减少（P＜0.05）（见图4）。

图4 网格测试左侧前肢滑落次数比较（ ± s）Figure 4 Comparison of left forelimb slips in grid test（ ± s）

与SHAM-S 组相比，SHAM-E 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的左侧后肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05）。 与SHAM-S 相比，PDS 组在第1、7、11、14、21、28 天的左侧后肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05），但在第4 天PDS 组的左侧后肢滑落次数显著增加（P＜0.05）。 与SHAM-E 相比，PDE组在第1、4、7 天的左侧后肢滑落次数均显著增加（P＜0.05），但二者在第11、14、21、28 天的左侧后肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05）。 与PDS组相比，PDE 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的左侧后肢滑落次数均无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图5 网格测试左侧后肢滑落次数比较（ ± s）Figure 5 Comparison of left hindlimb slips in grid test（ ± s）

与SHAM-S 组相比，SHAM-E 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的总步数均无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM-S 组相比，PDS 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的总步数均显著减少（P＜0.05）。 与SHAME 组相比，PDE 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的总步数均显著减少（P＜0.05）。 与PDS 组相比，PDE组在第1 天的总步数无统计学意义（P＞0.05），在第4、7、11、14、21、28 天的总步数均显著增加（P＜0.05）（见图6）。

图6 网格测试总步数比较（ ± s）Figure 6 Comparison of total steps in grid test（ ± s）

与SHAM-S 组相比，SHAM-E 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的行进格数均无统计学意义（P＞0.05）。 与SHAM-S 组相比，PDS 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的行进格数均显著减少（P＜0.05）。与SHAM-E 组相比，PDE 组在第1、4、7、11、14、21、28 天的行进格数均显著减少（P＜0.05）。 与PDS组相比，PDE 组在第1 天的行进格数无统计学意义（P＞0.05），但PDE 组在第4、7、11、14、21、28 天的行进格数均显著增加（P＜0.05）（见图7）。

图7 网格测试行进格数比较（ ± s）Figure 7 Comparison of progress girds in grid test（ ± s）

3 讨论

PD 是以运动功能障碍为主要临床特征的神经系统疾病，主要表现为运动徐缓、肌肉僵直、姿势步态异常、静止性震颤及动作协调模式转换能力降低等［18－21］。 PD 患者DA 能神经元丢失发生比较隐匿，因此，临床将运动功能评分作为判断PD 患者DA 能神经元存活率的参考依据。

感觉运动系统由感觉联合皮质、第二运动皮质、主运动皮质、小脑、基底神经节、感觉运动脊髓环路共同构成，按其结构等级可划分为上级的皮质联合及下级联合。 感觉运动发起于皮质联合，执行过程中感觉传入持续监测并反馈运动的发出是其主要特征［22］。 实验中，损伤动物一侧感觉运动皮质、纹状体或黑质-纹状体通路均可引起对侧躯体感觉运动功能的减少或同侧功能的增进［23］，即感觉运动出现不对称性现象。 利用这一特性，本研究分别使用圆筒测试、网格测试对PD 模型大鼠的感觉运动功能进行测评。 大量研究证实自发性运动与强迫性运动均有助于PD 模型大鼠运动功能障碍的改善及恢复。 本研究发现：伴随6-OHDA 注射后运动的早期介入，PDE 组大鼠的圆筒测试得分曲线呈现平稳下降趋势，而PDS 组呈现显著上升趋势。 伴随运动干预的介入与持续，左侧前肢的受损状态逐渐改善，双侧前肢的使用程度逐渐趋近于平衡，PD 大鼠在运动介入初期便可使其受损的感觉运动功能受到保护与修复，提示早期进行运动干预可能更有助于PD 模型大鼠感觉运动功能损伤症状的减轻以及病程的改善。

运动诱导的神经保护作用是指在PD 模型损伤前、损伤即刻介入运动所诱发的针对DA 能神经元凋亡的保护效应。 大量研究已经证实，运动有利于治疗PD：跑步机训练以及游泳等有氧运动有助于PD 患者步态和平衡能力的恢复［24－25］，拳击操、太极拳等运动可以显著改善PD 患者精细运动的功能障碍［26］。 当前研究认为，运动诱发的DAT 及VMAT-2水平下调是诱导神经保护作用的主要因素［27］，而运动干预介入时间及造模病毒注射滴度是影响神经保护作用的重要因素［28］。 本研究发现建模后即刻介入运动干预可以显著减缓黑质-纹状体DA 通路Str 内TH 含量的降低，提示早期运动干预可以有效延缓PD 模型大鼠黑质-纹状体通路DA 能神经元坏死。 其机制可能与运动诱导的神经再生，降低DAT的表达，减少DA 的清除率，增加DA 囊泡释放有关［29－31］。

综上所述，本研究探索了早期运动干预对PD大鼠模型感觉运动功能的影响，研究结果提示早期运动干预可以有效抑制黑质-纹状体通路DA 含量的下降，改善PD 模型大鼠的感觉运动功能障碍，并且运动干预效果随干预时间的延长增强。