血必净通过miR-155/JAK2/STAT1信号通路对肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠肺组织损伤的影响

2023-10-16尉飞王湘雨刘志勇

实用医学杂志 2023年18期

尉飞王湘雨刘志勇

1河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）（郑州 450000）；2河南中医药大学第二临床医学院（郑州 450011）

肺炎克雷伯菌是常见的致病菌，其引发的重症肺炎（SP）在临床上最为常见，近年来，克雷伯杆菌肺炎的发病率逐年升高［1-2］。由于该类肺炎对一般抗生素具有一定的耐药性，因此，寻找有效的治疗药物具有重要意义［3］。血必净是红花、赤芍、川芎、丹参、当归等提取物的注射液，临床上用于SP 及脏器衰竭等。近年来，有研究［4-5］证实血必净能够通过调控miR-233、miR-17-5P 等微小RNA，对肝、肺等的重要脏器起到保护作用损伤，因此，推测血必净能够通过某种机制调控微小RNA，降低SP 对肺部的损伤。微小RNA-155（miR-155）是一种多功能基因，转录后能够抑制目的基因的表达，参与免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生与发展等，是SP 研究中热门的基因之一，目前，血必净对SP 大鼠肺组织损伤的影响研究较少，其作用机制尚不清楚，而JAK2/STAT1 通路参与细胞的增殖、分化等多种途径，是免疫调节的重要通路［6-7］。因此，本研究通过建立SP 大鼠模型，探究血必净通过miR-155/JAK2/STAT1 通路对SP 大鼠肺组织损伤的影响，为治疗该疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级、SD雄性大鼠，体质量185 ～215 g，平均（200 ± 15）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证为［生产许可SCXK（京）2019-0010］。本研究经院动物伦理委员会审批通过。

1.2 主要试剂与仪器血必净注射液（国药准字Z20040033，天津红日药业股份有限公司）；miR-155 激动剂购于广州瑞博生物科技有限公司；肺炎克雷伯菌标准菌株购于上海硕欣生物科技有限公司；戊巴比妥钠（CAS：57-33-0，上海哈灵生物科技有限公司）；多聚甲醛（CAS：30525-89-4，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；TRIzol 试剂盒购于武汉纯度生物科技有限公司；IFN-γ、IL-4 试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购于北京康瑞纳生物科技有限公司；受体酪氨酸激酶2（JAK2）及其山羊抗兔二抗购于深圳市豪地华拓生物科技有限公司；信号转导和转录激活因子1（STAT1）单克隆抗体及及其山羊抗兔二抗（上海圻明生物科技有限公司）。

离心机（型号：M1324R，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；分析天平（型号：FA2204C，北京佳源兴业科技有限公司）；恒湿恒温箱购于上海连桥生物科技有限公司；Premier3000 大小鼠血气分析仪购于上海玉研科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠模型建立及分组将肺炎克雷伯菌，以生理盐水稀释为1.2 × 109cfu/mL 的菌液，备用。取50 只SD 雄性大鼠，随机选取8 只为对照组，其余大鼠建立SP 模型。将所有大鼠称重后进行麻醉处理（30 mg/kg，2%戊巴比妥钠），麻醉后固定于鼠板，对颈部进行常规消毒、备皮，暴露出气管上端，除对照组外，采用注射器经气管注入3 mL菌液，对照组注入等量的生理盐水。接种后使大鼠保持直立20 s，便于菌液进入肺部，缝合伤口，密切关注大鼠生命体征。当大鼠、表情呆滞、呼吸急促、活动量明显减少，且经血气分析仪检测动脉氧分压≤ 8 kPa 时，建模成功［8］。

建模过程中2 只建模过程中死亡，其余大鼠随机分为模型组，miR-155 激动剂组，血必净低、高组及miR-155 激动剂+血必净组，每组各8 只。

1.3.2 药物处理参照人与大鼠药物计量换算系数［9］，miR-155 激动剂组给予miR-155 激动剂80 mg/kg，血必净低、高剂量组分别给予血必净注射液4、8 mg/kg，miR-155 激动剂+血必净组给予miR-155 激动剂80 mg/kg 和血必净8 mg/kg，对照组与模型组均给予等量的生理盐水，均尾静脉注射，每天1 次，连续给药7 d。

1.3.3 标本采集及处理给药7 d 后，禁食12 h，采集大鼠眼眶静脉血5 mL，2 mL 冷藏保存，用于miR-155 检测，剩余血液离心5 min（转速：5 000 r/min，离心半径：10 cm），取上层血清，于-80 ℃冷藏箱中冷冻保存。所有大鼠麻醉后处死，取大鼠全肺，用于称重并计算肺系数（LI），每组取4 只大鼠全肺用于测量湿重/干重比值（W/D），另外4 只右肺于4%多聚甲醛固定，用于HE 染色，左肺于液氮中冷冻保存，用于qRT-PCR 及免疫印迹法检测mRNA 及蛋白表达量。

1.3.4 大鼠肺系数（LI）及湿重/干重比值（W/D）取大鼠全肺，采用滤纸擦干肺组织表面水分，称重，根据公式计算LI，［LI=肺质量（mg）/体质量（g）×10］。称取全肺湿重后，置于恒温箱（80 ℃）中连续烘烤20 h，称取干重，计算W/D 值。

1.3.5 大鼠血清白细胞介素-1β（L-1β）、白细胞介素-18（L-18）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平取上清液，室温解冻后进行血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平检测，采用全自动生化分析仪，以酶联免疫（ELISA）双抗夹心法进行检测，按照相应ELISA 试剂盒说明书操作。

1.3.6 大鼠肺组织病理检测取部分固定的大鼠肺组织，乙醇脱水后进行石蜡包埋，切片（4 μm）后进行HE 染色，采用光学显微镜观察大鼠肺组织水肿、炎症细胞浸润等病理学变化。

1.3.7 qRT-PCR 检测大鼠miR-155 表达情况［10］取静脉血2 mL，室温解冻后根据TRIzol 试剂盒说明书，提取总RMA，经逆转录反应得到cDNA，进行qRT-PCR 检测根据试剂盒说明书建立反应体系：Master Mix10 μL，cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶酶0.4 μL；纯水加至20 μL；反应条件：95 ℃，30 s→60 ℃，15 s→72 ℃，10 s，循环40 次。以U6 为内参，采用2-△△CT法计算miR-155表达量，引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primevs

1.3.8 大鼠肺组织JAK2、STAT1 mRNA 表达情况取部分冻存肺组织约0.5 g，研磨成匀浆，采用TRIzol法提取肺组织总RMA，经逆转录得到cDNA，按照荧光定量PCR 试剂盒说明书进行操作，建立反应体系（10 μL）：SYBR Green 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL；扩增条件：95 ℃，30 s，60 ℃，15 s，72 ℃，10 s，循环40 次［11］。以GAPDH 为内参，采用2-△△CT法计算JAK2、STAT1 mRNA 表达量，引物序列见表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primevs

1.3.9 大鼠肺组织JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 蛋白表达情况取部分液氮保存的肺组织，将其研磨成匀浆并加入RIPA 缓冲液，离心后提取上清液，采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，煮沸5 min 后进行电泳，分离目的蛋白，转膜后室温封闭2 h，加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 一抗及内参，4 ℃孵育过夜，冲洗后加入山羊抗兔二抗，室温孵育2 h，再次冲洗，最终进行ECL 显影，并分析结果。蛋白表达量为目的蛋白条与β-Actin 带灰度值的比值［12］。

1.4 统计学方法用SPSS 22.0 软件分析数据，符合正态分布的计量资料均以均数±标准差表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠LI 及肺W/D 值比较与对照组比较，模型组LI 及肺W/D 值均升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，miR-155 激动剂组LI 及肺W/D 值升高，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组LI 及肺W/D 值均降低（P＜ 0.05）；与miR-155 激动剂组比较，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组LI 及肺W/D 值均降低（P＜ 0.05），与血必净低剂量组比较，血必净高剂量组LI 及肺W/D 值升高（P＜ 0.05），与血必净高剂量组比较，miR-155激动剂+血必净组LI 及肺W/D 值升高（P＜ 0.05）。见图1。

图1 大鼠LI 及肺W/D 值Fig.1 LI and lung W/D values in rats

2.2 大鼠血清IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平比较与对照组比较，模型组IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平均升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，miR-155 激动剂组IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平升高，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组IL-1β、IL-18及TNF-α水平降低（P＜ 0.05）；与miR-155激动剂组比较，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平降低（P＜ 0.05），与血必净低剂量组比较，血必净高剂量组IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平降低（P＜ 0.05），与血必净高剂量组比较，miR-155 激动剂+血必净组IL-1β、IL-18及TNF-α 水平升高（P＜ 0.05）。见表3。

表3 大鼠血清IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平比较Tab.3 Comparison of serum IL-1β，IL-18 and TNF-α levels in rats ±s，mg/kg

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与miR-155激动剂组比较，cP＜0.05；与血必净低剂量组比较，dP＜0.05；与血必净高剂量组比较，eP＜0.05

TNF-α 66.53 ± 5.22 102.31 ± 7.34a 118.28 ± 9.26ab 84.68 ± 7.08abc 75.85 ± 6.82abcd 83.71 ± 7.25abde组别对照组模型组miR-155激动剂组血必净低剂量组血必净高剂量组miR-155激动剂+血必净组鼠量8 8 8 8 8 8 IL-1β 52.83 ± 6.12 87.48 ± 8.24a 96.38 ± 9.24ab 80.31 ± 8.35abc 66.23 ± 6.03abcd 79.77 ± 8.05abde IL-18 92.34 ± 8.38 238.87 ± 10.54a 253.15 ± 12.06ab 172.38 ± 7.49abc 113.23 ± 10.03abcd 168.77 ± 9.05abde

2.3 大鼠肺组织病理检测结果对照组：肺组织结构完整，肺泡大小均匀；模型组：肺泡完整性遭到破坏，可见肺泡水肿，肺间质增厚，伴随炎症细胞浸润；miR-155 激动剂组：肺泡结构破坏、水肿等情况较模型组严重，炎症细胞浸润增多；血必净低剂量组：肺泡结构部分恢复，水肿减轻，炎症细胞浸润部分减少；血必净高剂量组：肺泡结构基本恢复，水肿减轻，炎症细胞浸润明显减少；miR-155 激动剂+血必净组：肺泡结构部分恢复，水肿部分减轻，炎症细胞浸润明显局部减少，但减轻程度小于血必净高剂量组。见图2。

2.4 大鼠miR-155 表达量比较与对照组比较，模型组miR-155 表达升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，miR-155 激动剂组miR-155 表达升高，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组miR-155表达均降低（P＜ 0.05）；与miR-155 激动剂组比较，血必净低、高剂量及miR-155 激动剂+血必净组miR-155表达降低（P＜ 0.05），与血必净低剂量组比较，血必净高剂量组miR-155 表达降低（P＜ 0.05），与血必净高剂量组比较，miR-155 激动剂+血必净组miR-155 表达升高（P＜ 0.05），见表4。

表4 大鼠miR-155 表达量比较Tab.4 Comparison of relative expression levels of rat miR-155 ±s

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与模型组比较，bP ＜ 0.05；与miR-155激动剂组比较，cP ＜ 0.05；与血必净低剂量组比较，dP ＜ 0.05；与血必净高剂量组比较，eP ＜ 0.05

miR-155 1.00 ± 0.02 3.29 ± 0.72a 3.72 ± 0.82ab 2.63 ± 0.61abc 1.90 ± 0.55abcd 2.60 ± 0.60abce组别对照组模型组miR-155激动剂组血必净低剂量组血必净高剂量组miR-155激动剂+血必净组鼠量8 8 8 8 8 8

2.5 大鼠肺组织JAK2、STAT1 mRNA 表达情况与对照组比较，模型组JAK2、STAT1 mRNA 表达升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，miR-155 激动剂组JAK2、STAT1 mRNA 表达升高，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组JAK2、STAT1 mRNA 表达均降低（P＜ 0.05）；与miR-155 激动剂组比较，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组JAK2、STAT1 mRNA表达降低（P＜ 0.05），与血必净低剂量组比较，血必净高剂量组JAK2、STAT1 mRNA表达降低（P＜ 0.05），与血必净高剂量组比较，miR-155 激动剂+血必净组JAK2、STAT1 mRNA 表达升高（P＜ 0.05），见表5。

表5 大鼠肺组织JAK2、STAT1 mRNA 表达量比较Tab.5 Comparison of the relative expression of JAK2 and STAT1 mRNA in rat lung tissue ±s

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与模型组比较，bP ＜ 0.05；与miR-155激动剂组比较，cP ＜ 0.05；与血必净低剂量组比较，dP ＜ 0.05；与血必净高剂量组比较，eP ＜ 0.05

STAT1 mRNA 1.00 ± 0.03 3.31 ± 1.26a 4.07 ± 1.68ab 2.98 ± 0.43abc 2.27 ± 0.77abcd 3.02 ± 0.48abde组别对照组模型组miR-155激动剂组血必净低剂量组血必净高剂量组miR-155激动剂+血必净组鼠量8 8 8 8 8 8 JAK2 mRNA 1.00 ± 0.05 2.89 ± 0.96a 3.27 ± 1.01ab 1.88 ± 0.44abc 1.31 ± 0.24abcd 1.90 ± 0.40abde

2.6 大鼠肺组织JAK2、STAT1 蛋白表达情况与对照组比较，模型组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，miR-155 激动剂组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 均降低（P＜ 0.05）；与miR-155 激动剂组比较，血必净低、高剂量组及miR-155激动剂+血必净组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1降低（P＜ 0.05），与血必净低剂量组比较，血必净高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 降低（P＜0.05），与血必净高剂量组比较，miR-155 激动剂+血必净组p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高（P＜0.05），见表6、图3。

图3 肺组织JAK2、STAT1 蛋白表达图Fig.3 Expression of JAK2 and STAT1 protein in lung tissue

表6 大鼠肺组织p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 比较Tab.6 Comparison of p-JAK2/JAK2，p-STAT1/STAT1 in rat lung tissue ±s

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与模型组比较，bP ＜ 0.05；与miR-155激动剂组比较，cP ＜ 0.05；与血必净低剂量组比较，dP ＜ 0.05；与血必净高剂量组比较，dP ＜ 0.05

p-STAT1/STAT1 0.31 ± 0.03 0.58 ± 0.03a 0.81 ± 0.02ab 0.41 ± 0.04abc 0.29 ± 0.04abcd 0.43 ± 0.04abde组别对照组模型组miR-155激动剂组血必净低剂量组血必净高剂量组miR-155激动剂+血必净组鼠量4 4 4 4 4 4 p-JAK2/JAK2 0.24 ± 0.02 0.48 ± 0.04a 0.83 ± 0.03ab 0.26 ± 0.04abcd 0.21 ± 0.03abcd 0.28 ± 0.04abde

3 讨论

血必净是一种中药注射液，主要成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归等中药材提取物，临床中常用作呼吸道等疾病的炎症反应或器官衰竭的治疗［13］。肺炎克雷伯菌引发的SP，或对肺组织造成不同程度的损伤，由于该类肺炎对常规抗生素具有一定的抗药性，因此中药被开始治疗该类疾病［14-15］。有研究［16］显示血必净对于应激性器官损伤具有一定的保护作用，因此，推测血必净对SP 大鼠肺组织损伤具有一定的保护作用。JAK2/STAT1 信号通路与机体的免疫作用相关，而miR-155 在免疫调节中具有重要作用，同时在炎症反应的研究中较为热门［17-19］。本研究建立SP 大鼠，探究血必净通过miR-155/JAK2/STAT1 通路对SP 大鼠肺组织损伤影响及其作用机制。

本研究对各组SP 大鼠的LI，肺W/D 及血清炎症因子进行检测，结果显示模型组LI，肺W/D，IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平升高，表明SP 会引发炎症反应，并对肺组织造成一定损伤，而miR-155 激动剂会加重炎症反应及肺损伤；在给予模型大鼠或miR-155 激动剂模型大鼠血必净后，LI，肺W/D，IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平上升，IL-1β、IL-18 及TNF-α 均为促炎因子，注射血必净后，促炎因子受到抑制，表明血必净对于炎症反应有很好的抑制作用，进而减少对肺组织的损伤，起到保护肺组织的作用，同时能够减少部分miR-155 激动剂带来的损伤，其中高剂量血必净保护作用更强。分析原因为，血必净注射液中具有红花、赤芍、川芎、丹参、当归五中中药提取物，多个治疗靶点，具有更好的抗炎效果，同时还具有抗氧化、改善微循环，保护上皮细胞的作用，通过多种机制对SP 造成的肺损伤具有一定的保护作用［20-21］。另外大鼠的肺组织病理学结果显示，miR-155 能够增加SP对肺组织造成的结构破坏，加重水肿及炎症细胞浸润，而血必净则会改善肺泡结构，减轻水肿，减少炎症细胞浸润，推测其能够通过抑制炎症反应减轻肺部损伤。

JAK2/STAT1 通路是免疫调节反应中的重要途径，参与细胞的增殖、分化等，多数细胞因子由该通道进行信号转导［22-23］。吴舒懋等［24］研究而结果显示，SP 肺组织中，升高mir-34a 表达，能够抑制sirt1 表达，加重肺损伤；降低mir-34a 表达表达，能够促进sirt1 表达，减轻肺损伤。吴程程［25］等证实，血必净通过调控p38 MAPK/NF-kB 通路，降低百草枯中毒大鼠的炎症反应，减少对肺组织的损伤。根据以上研究结果推测血必净可能通过miR-155调控JAK2/STAT1 通路，起到对肺部的保护作用。本研究结果显示，模型组、miR-155激动剂组JAK2、STAT1 mRNA 及p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高，表明SP 的会激活JAK2/STAT1 通路，该通路可能由miR-155 进行调控，当JAK2 激活后，使STAT1磷酸化形成p-STAT1，STAT1 活化巨噬细胞系统，调控促炎因子的表达，促进炎症反应［26］。另外，血必净低、高剂量组及miR-155 激动剂+血必净组JAK2、STAT1 及p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 降低，表明血必净可抑制JAK2/STAT1 通路，从而抑制SP 引起的炎症反应，同时能降低部分miR-155激动剂对JAK2/STAT1 通路的激活作用，提示血必净对JAK2/STAT1 通路的调控作用可能是通过miR-155 进行。

综上所述，miR-155 在SP 大鼠肺组织中表达升高，血必净能够通过抑制miR-155 降低JAK2/STAT1 信号通路，减轻肺损伤。但本研究具有一定的局限性，仅对肺部损伤的可能机制之一进行研究，而肺损伤会受到多种通路及因子影响，因此应对其他可能机制进行深入研究，为临床治疗SP提供给新有效药物；在外界条件限制下未设置miR-155 拮抗剂组为血必净的作用机制提供佐证，可作为研究方向，进一步验证血必净可能机制。

【Author contributions】WEI Fei performed the experiments and wrote the article.WANG Xiangyu performed the experiments.WANG Xiangyu and LIU Zhiyong revised the article.LIU Zhiyong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.