体外膜肺氧合中血栓炎症反应及管路生物相容性的研究进展*

马啸龙,陈博,刘成,苏扬,郭弯弯,乔蕊(.北京大学第三医院检验科,北京009;.北京大学医学部,北京009)

体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation, ECMO)是在重度心肺功能衰竭时,使用机器部分或全部提供心、肺功能支持的一种生命支持技术[1]。自新型冠状病毒爆发以来,ECMO在危重症患者的支持治疗方面取得了良好的成效。但是,ECMO在为患者提供心肺支持的同时,常伴随出现一系列并发症,如氧合器堵塞、感染等。而其中最重要的,则是由于血液长时间暴露在人工管道和膜表面,导致体内非特异免疫的广泛激活,触发血栓形成、炎症反应和氧化应激,引发体内系统性血栓炎症反应,导致或进一步加重器官损伤[2-3]。目前,针对于ECMO管路接触引起血栓和炎症的主要预防措施是使用普通肝素,但抗凝药物的使用是导致出血并发症的原因之一,出血发生率可高达30%～70%[4],因此,ECMO管路材料的生物相容性改进同样重要。本文就ECMO中血栓炎症反应的机制和ECMO管路材料生物相容性改进研究进展进行探究总结,希望为临床ECMO治疗和相关研究提供参考。

1 ECMO中的血栓-炎症反应

当患者的血液接触到ECMO的异物表面时,多个系统被迅速激活,主要包括凝血系统、补体系统、内皮细胞、白细胞、血小板和细胞因子,这导致血栓形成和炎症反应同时存在。这种ECMO相关血栓-炎症反应类似于全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),可能会导致内皮损伤和内脏功能障碍[5-10]。

1.1凝血系统 凝血系统中参与ECMO管路接触激活的主要有以下血浆蛋白:凝血因子(F)Ⅻ、FⅪ、高分子激肽原(high molecular weight kininogen,HMWK)和前激肽释放酶(Fletcher因子)。

当血液与体外循环管路表面接触时,内源性凝血途径迅速启动,FⅫ激活为FⅫa,FⅫa在ECMO启动后10 min内即可达到最高水平[11]。FⅫa是凝血系统接触激活的最初产物,FⅫa接下来激活FⅪ成为FⅪa,FⅪa将FⅨ转化为FⅨa,进而激活FⅩ。

此外,FⅫa还可以将前激肽释放酶转化为活性激肽释放酶,将HMWK转化为缓激肽。激肽释放酶和缓激肽除了起促进凝血的作用外,还能促进炎症的发生,缓激肽具有多效性,包括刺激一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-10的释放,体外循环中激肽释放酶的产生也可以直接激活中性粒细胞。研究表明,通过使用一种抑制性抗体中和FⅫa可以在体外实验和动物模型中减少ECMO的炎症[12]。

一般来说,外源性凝血途径在体外循环中的作用较小,因为外源性凝血途径激活需要组织损伤和其引起的组织因子(tissue factor,TF)暴露。但实际上,TF也会存在于体外循环中,并处于促炎症状态[13]。在体外循环中,激活的补体能诱导单核细胞表达TF,TNF-α和IL-6也可以诱导内皮细胞表达可溶性TF[14]。

不管通过哪种途径,共同途径中激活的FⅩ将凝血酶原转化为凝血酶,凝血酶将纤维蛋白原裂解成纤维蛋白,导致血栓形成。另一方面,凝血酶除了在凝血中起作用外,在炎症中也起着重要作用,其能增加内皮细胞P-选择素和E-选择素的表达,以及中性粒细胞的黏附和激活。凝血酶还诱导内皮细胞产生血小板激活因子(platelet activating factor,PAF),这是另一种中性粒细胞的激活剂,能影响中性粒细胞表达促炎细胞因子[15]。

1.2血小板 在与ECMO管路接触后,血小板被激活并开始黏附在纤维蛋白原上,促进凝血酶生成,引发血栓。近些年,人们发现除了参与血栓和止血的过程,血小板更是介导非特异免疫炎症反应和促进炎症反应放大的重要细胞[16]。它可以通过表面受体表达、颗粒内容物释放、微粒释放等方式与许多免疫细胞相互作用,参与到机体的炎症反应中。

活化血小板上表达的CD40配体和内皮细胞上的CD40相互作用,促进中性粒细胞的组织迁移,诱发内皮细胞中趋化因子和黏附分子的产生和释放。另外,活化血小板与中性粒细胞和单核细胞结合,可能诱导其分泌促炎症细胞因子和单核细胞表达TF,引发这些免疫细胞的促炎作用。

此外,血小板的激活会引起形状的改变,导致血小板向循环中释放颗粒,血小板颗粒含有多种可溶性介质,包括趋化因子、促炎症细胞因子、蛋白酶、黏附因子、生长因子、血管生成因子和止血因子[17]。这可以进一步促进其他血小板、白细胞和内皮细胞对ECMO的炎症反应[18-19]。

近年来研究发现,血小板活化后有一群发生气球样改变,称为促凝血小板。促凝血小板内结构性表达炎症小体组成部分[20],生成在无菌性炎症中发挥关键作用的IL-1β,并包裹在血小板微粒中释放,这些血小板微粒可以通其携带的 IL-1β介导内皮和远距离组织炎症损伤[21]。研究表明在许多疾病中,血小板源性微粒的含量增多。例如在类风湿关节炎患者中,其关节液中含有大量的带有血小板标志物CD41a的微粒[22]。但是血小板微粒与ECMO炎症反应的关系尚无相关研究。

1.3补体系统 补体系统是ECMO启动时人体最先启动的宿主防御系统之一。补体系统激活和裂解的循环产物,包括C3a、C4a和C5a,可以激活血小板和内皮细胞,增加毛细血管的通透性和血管张力,引发炎症反应。

在补体激活的三种启动途径中,经典途径和凝集素途径是由抗原-抗体复合物形成诱导的,而替代途径可以直接由血液与ECMO管路的生物材料接触裂解C3诱导,因此,人们认为替代途径是ECOM期间补体激活的主要手段。然而,在ECMO期间FⅫa激活补体蛋白C1、丙胺-肝素复合物形成、缺血-再灌注期间肠道释放内毒素,因此,补体系统也可以通过经典途径被激活[23-24]。

关于ECMO期间补体系统激活及其对患者预后影响的研究很少,且都是在20世纪90年代进行的[25-26],管路材料生物相容性优化和离心泵的改进可能对ECMO期间补体激活水平产生影响,例如研究表明现代ECMO中普遍使用的肝素包被管路材料可以减少补体的激活[27]。

一些文献分别对ECMO体外模型[28]、新生儿ECMO[28]和成年患者ECMO[25]中的补体激活进行了研究,显示ECMO期间补体因子的水平迅速升高,峰值出现在1至2小时内。Vallhonrat等[25]描述了两名接受ECMO的成年急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者,其C3b和补体终末复合物(terminal complement complex,TCC)的水平迅速升高,这在ECMO开始的15 min内很明显。但水平在60 min前就达到峰值,180 min后开始下降,2 d后达到接近基线水平。

1.4白细胞 一般来说,白细胞被认为是ECMO期间诱发炎症和氧化应激反应的主要参与者之一。补体在体外循环开始时几乎瞬间激活中性粒细胞,研究表明加入针对C5的人类单克隆抗体可明显抑制激活[29]。ECMO的体外模型显示,中性粒细胞的激活在最初的30 min内急剧增加,几小时内达到高峰,此后逐渐下降,并且白细胞并不粘附在管路上[30]。

一旦被激活,中性粒细胞就会脱颗粒,释放储存的细胞毒性酶,如中性粒细胞弹性蛋白酶、骨髓过氧化物酶和溶菌酶。此外,通过呼吸爆发,中性粒细胞也能够释放有细胞毒性的活性氧。在ECMO期间,中性粒细胞正是通过这些机制,在血管内和迁移到组织后,成为器官损伤的影响者[31]。

单核细胞也会因ECMO被激活[30],尽管比中性粒细胞的激活更慢[23]。当受到适当的刺激时,单核细胞可能会分泌一些促炎症的细胞因子。

1.5内皮细胞 内皮功能障碍是ECMO治疗的危重症患者不良后果的一个重要标志[32-33]。尽管不直接与体外循环接触,血管内皮在ECMO期间的炎症反应中也起着关键作用。与SIRS类似,体外循环产生的炎症介质导致内皮细胞广泛激活,在一些细胞因子、补体产物和活性氧的作用下,内皮细胞的基因表达发生改变。被激活的内皮细胞反过来分泌促炎症细胞因子并增加其黏附分子的表达,导致白细胞的迁移增加。

补体介导的内皮细胞激活很短暂,因此,促炎症细胞因子循环水平的增加是内皮细胞激活的主要原因。TNF-α和IL-1β可能是这个过程中最重要的细胞因子[23]。无论哪种机制的内皮激活都会导致被激活的中性粒细胞的募集、滚动、黏附和迁移。

1.6红细胞 尽管血液接触ECMO人造管路不会对红细胞产生影响,但红细胞在ECMO血栓-炎症反应中仍起重要作用。当血液在ECMO治疗中以不同速度通过管路、离心泵、氧合器,会导致红细胞受到不同剪切力的作用,因此溶血的发生是不可避免的[34-35]。破裂的红细胞会释放出游离血红蛋白、血红素和铁蛋白。研究表明,在猪ECMO模型的4 h循环期间,游离血红蛋白大约每小时增加0.02 mmol/L[32]。

游离血红蛋白和血红素能通过触发免疫系统和补体系统,诱发或加剧炎症反应和氧化应激,从而导致终端器官损伤。铁蛋白从亚铁状态转化为铁状态时,能产生高活性的羟基自由基,进一步促进氧化应激和对脂质及蛋白质的相关修饰,改变细胞膜的极性和渗透性,使细胞更容易被裂解[36]。此外,由于溶血或红细胞应激反应,红细胞会向循环中释放各种促炎症细胞因子和趋化因子。

2 ECMO管路生物相容性改进

多年来,人们一直希望通过优化ECMO设备来减少患者的并发症,例如为减少高剪切力,可以通过优化离心泵设计和在临床中调整插管位置和深度改变患者转速流量比而实现。人们同时希望通过ECMO管路的修饰来模仿生理条件,提高材料的生物相容性,减少患者血液与管路接触引发的血栓形成和炎症反应。目前主要的管路生物相容性修饰方式可以分为三大类[37]:生物活性表面、生物惰性表面以及表面的内皮细胞化。

2.1生物活性表面 生物活性表面指的是将能发挥生物活性的物质涂抹包被在材料上,其中发展最早的包被方式是将肝素包被在ECMO管路上,通过降低全身肝素化来减少出血的风险[38],Carmeda公司在1983年就开发了商品化的肝素涂层ECMO管路[39-40]。肝素涂层管路通过肝素的局部释放可以最大限度地减少血液与人造管路接触时产生的负面影响[41],早期研究发现肝素涂层能减少45%的补体激活[42]。研究表明,相比于没有涂层的设备,有肝素的氧合器可以减少以下影响:接触后凝血系统激活、补体系统激活,血小板激活,粒细胞激活,炎症,平衡紊乱和脑损伤等[43]。

然而,一些研究表明,氧合器上的肝素涂层减少了部分炎症反应和血栓形成,但与无涂层的氧合器相比,其他并发症几乎相同。目前,大部分相关研究是在短时间(小于6 h)的体外实验或在短期体外循环中进行的,因此对于ECMO这类需长期支持的治疗,这些研究结果并不充分。

NO包被是目前一种比较接近应用于临床的包被方式,NO由内皮细胞释放以诱导血管舒张,能促进血小板和血管平滑肌细胞中环状单磷酸鸟苷(GMP)的增加,由此抑制血小板的活化和黏附[37]。研究表明,在体外循环中NO涂层具有良好的抗血栓形成特性[44]。目前的NO涂层产生和输送NO的能力不足,保存期也不能超过4周,限制了其应用于长期建立体外生命支持患者中的应用[4]。目前NO涂层尚无商品化的ECMO管路应用,但已应用于临床支架产品[45]。

2.2生物惰性表面 构建生物惰性表面的目的是减少血液与管路接触时的生物反应。1980年以来,人们将清蛋白用作涂层材料,构建具有亲水表面的基础层,能减少对疏水表面的生物反应[46],它通常适用于肝素禁忌症的情况[47]。清蛋白缺乏与血小板、白细胞和凝血酶的结合序列,因此清蛋白用作涂层时,可以减缓血小板的激活。但是在循环过程中,清蛋白会被血浆蛋白取代,因此清蛋白的涂层不能维持长时间稳定[47]。目前常作为多层生物活性涂层的一部分,与肝素联合使用。

目前有很多研究尝试通过将高分子聚合物包被在ECMO管路壁,降ECMO管路的反应性。聚-2甲氧基乙基丙烯酸酯(PMEA)是一种血液相容的聚合物,由疏水性的聚乙烯链和温和的亲水尾部组成,能为血液创造一个亲水性的表面,蛋白质和血小板不会变性或黏附在上面。体外循环的动物模型中也显示亲水表面可以抑制补体系统的激活[37]。在接受冠状动脉旁路移植的患者中,PMEA涂层在减少血小板黏附、聚集和蛋白质吸附方面具有优势[48]。然而,其他研究发现,使用PMEA涂层患者术后白细胞减少和全身炎症反应综合征(SIRS)的风险较高,且血小板聚集没有减少[49]。

与此类似的还有聚氧化乙烯(PEO)和聚-MPC-BMA-TSMA(PMBT),一些体外实验和动物模型中,证明了这些涂层与肝素涂层在一些方面没有差异[50],并优于无涂层管路[51]。但是,对于这些高分子材料的包被是否优于肝素包被,目前尚没有共识。

2.3表面内皮细胞化 表面内皮化是指希望通过在管路表面种植细胞构建内皮层,实现血液和材料之间完全的血液相容性。相比于其他希望通过模仿内皮细胞特性来调节血栓-炎症的包被方式,用内皮细胞将实现更高的血液相容性。目前有研究调查了在ECMO气体交换膜上建立内皮单层的可行性[52],由于内皮细胞不易粘附在疏水表面[47],因此材料的基底必须能使内皮细胞附着和粘合,同时保留内皮细胞的活力。研究发现,肝素/清蛋白涂层的膜纤维是一个良好的基底,可使内皮细胞附着形成内皮单层。此外,肝素/清蛋白涂层还能避免未被细胞覆盖区域发生血栓[53]。

但是,内皮化技术的成本、生产时效、质量保证等问题仍未解决。例如在低温条件下,内皮化氧合器的保质期为2周[54],而其他涂层氧合器的保质期一般为2年。因此这仍是一个需大量实验研究的领域。

3 总结

ECMO具备强大的心肺支持能力,在危重患者救治中发挥着重要的作用,而随着设备的完善和医学的发展,这种支持的应用在未来可能会继续增加。尽管目前在改进ECMO设备和保护血液方面已有一些进展,但患者的死亡率仍很高。因此,充分研究ECMO患者血栓炎症反应的发病机制,以及如何通过优化ECMO管路及抗凝策略抑制血栓炎症反应,具有很高的临床意义和价值。