三七总皂苷治疗血管内皮损伤性血栓功效评价研究

严灿梅 吕林艳 梁云飞 兰 星 黄宇声 郑志远　

三七总皂苷治疗血管内皮损伤性血栓功效评价研究

严灿梅1,2吕林艳1,2梁云飞1,2兰 星1,2黄宇声1,2郑志远1,2

（1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000；2.广西三七综合利用技术重点实验室，广西 梧州 543000）

目的：利用斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型评价三七总皂苷对血管内皮损伤性血栓功效。方法：普纳替尼建立斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型，三七总皂苷在28℃处理条件下18 h后测定MTD、心脏红细胞染色强度及血流速度。结果：三七总皂苷样品1、三七总皂苷样品3和三七总皂苷样品4对模型斑马鱼的MTD均为250 ng/尾，三七总皂苷样品2对模型斑马鱼的MTD为62.5 ng/尾。三七总皂苷样品均可增加模型斑马鱼心脏红细胞染色强度、血流速度。结论：三七总皂苷具有改善斑马鱼血管内皮损伤性血栓功效。

三七总皂苷；血管内皮损伤；血栓；功效

引言

三七总皂苷（Panax notoginsenosides，PNS），是三七的主要活性成分，单体主要包括人参皂苷Ra、Rb1、Rc、Rg1、Rd、Re等，其他成分为多糖、蛋白质、微量元素等，在活血化瘀、改善微循环、通脉活络等方面有较好活性，被广泛用于治疗心脑血管等疾病。目前，利用斑马鱼模型研究三七总皂苷的活血化瘀作用文献报道较少。本文通过研究不同比例三七总皂苷对血管内皮损伤性血栓模型斑马鱼的作用，探讨不同比例三七总皂苷活血化瘀作用，为提高三七总皂苷有效成份含量提供依据。

1 试验材料

1.1 试验样品

三七总皂苷样品1（皂苷含量为Rg1＞R1＞Rb1＞Re＞Rd）、三七总皂苷样品2（皂苷含量为Rg1＞Rb1＞R1＞Re＞Rd）、三七总皂苷样品3（皂苷含量为Rb1＞Rg1＞R1＞Rd＞Re）和三七总皂苷样品4（皂苷含量为Rb1＞Rg1＞Rd＞R1＞Re），来源于广西梧州制药（集团）股份有限公司。各样品用氯化钠注射液配制成100 mg/mL母液，在-20℃环境下分装储存。

1.2 试验动物

受精后5天（5 dPf）黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，用于样品治疗血管内皮损伤性血栓功效最大检测剂量（MTD）测定及其功效评价。

斑马鱼饲养条件为水温28℃，水质：200 mg速溶海盐/1L纯化水，pH调至6.5～8.5，电导率为450～550 μS/cm，硬度为50～100 mg/L CaCO3。斑马鱼均由杭州环特生物科技股份有限公司饲养，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际实验动物评估和认可管理委员会（AAALAC）认证（认证编号001458）的要求。

1.3 仪器与试剂

仪器：显微镜（日本OLYMPUS，SZX7）；显微注射仪（日本Narishige，IM300）；CCD相机（上海土森视觉科技有限公司，VerA1）；拉针仪（日本Narishige，PC-10）；心跳血流分析系统（法国ViewPoint Life Sciences，ZebraBlood3.4）；精密电子天平（美国OHAUS，CP214）。

试剂：氯化钠注射液（批号S21091609，湖南科伦制药有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，批号BCCD8942，Sigma公司）；甲基纤维素（批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；普纳替尼（批号13771，美国MedChemExPress公司）；邻联茴香胺（批号MKBX3619V，Sigma公司）。

2 试验方法

2.1 MTD测定

随机选取5 dPf斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。分别静脉注射给予三七总皂苷样品1、三七总皂苷样品2、三七总皂苷样品3和三七总皂苷样品4（剂量见表1），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。除正常对照组外，其余各组均水溶给予普纳替尼建立斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型，在28℃条件下处理18 h后，测定样品对模型斑马鱼的MTD。

2.2 治疗血管内皮损伤性血栓功效评价

于6孔板中，每孔随机处理斑马鱼30尾，以静脉注射的给药方式分别给予三七总皂苷样品1组、三七总皂苷样品2组、三七总皂苷样品3组和三七总皂苷样品4（剂量见表2），设正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。模型对照组及三七总皂苷各样品组均水溶给予普纳替尼建立斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型，28℃条件下处理18 h后，邻联茴香胺染色，每组随机挑选10尾斑马鱼于解剖显微镜下观察，收集数据，统计分析斑马鱼心脏红细胞染色强度，以此指标评价三七总皂苷样品治疗血管内皮损伤性血栓功效。数据采用SPSS26.0软件进行统计分析，＜0.05时为差异有统计学意义。

2.3 血管内皮损伤性血栓血流动力学改善功效评价

随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔30尾，设正常对照组、模型对照组、三七总皂苷样品1、三七总皂苷样品2、三七总皂苷样品3和三七总皂苷样品4组，每孔容量为3 mL，各给药组以静脉注射方式分别给予相应的三七总皂苷样品。除正常对照组外，其余各组均水溶给予普纳替尼建立斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型，在28℃条件下处理18h后，每组随机选取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析统计斑马鱼血流速度，评价不同成分配比的三七总皂苷样品对血流动力学改善功效。结果用SPSS26.0软件进行统计学分析，＜0.05表明差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 MTD

在本实验条件下，三七总皂苷样品1、三七总皂苷样品3和三七总皂苷样品4对模型斑马鱼的MTD均为250 ng/尾，三七总皂苷样品2对模型斑马鱼的MTD为62.5 ng/尾。详见表1。

表1 样品治疗血管内皮损伤性血栓功效剂量摸索实验结果（n＝30）

3.2 治疗血管内皮损伤性血栓功效评价

在本次实验条件下，与正常对照组比较，纳普替尼处理18 h后模型对照组心脏红细胞染色强度明显降低（＜0.001），表明血管内皮损伤性血栓模型建立成功。与模型对照组比较，三七总皂苷样品1在62.5、125及250 ng/尾浓度下均可显著增加斑马鱼心脏红细胞染色强度，具有统计学差异（＜0.05，＜0.001，＜0.001）；三七总皂苷样品2的62.5 ng/尾浓度组可增加心脏红细胞染色强度，具有统计学差异（＜0.001）；三七总皂苷样品3的62.5、125和250 ng/尾浓度组均可增加心脏红细胞染色强度，具有统计学差异（＜0.05，＜0.05，＜0.001）；三七总皂苷样品4的62.5、125、250 ng/尾浓度组均可增加心脏红细胞染色强度，具有统计学差异（＜0.05，＜0.01，＜0.01）。详见表2、图1和图2。

表2 样品治疗血管内皮损伤性血栓功效评价实验结果（n＝10）

注与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

图1 斑马鱼心脏红细胞染色强度典型图

注：蓝色虚线框处为分析部位斑马鱼心脏。

图2 斑马鱼心脏红细胞染色强度

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.3 血管内皮损伤性血栓血流动力学改善功效评价

在本次实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组在造模18 h后血流速度明显下降（＜0.001），表明模型建立成功。与模型对照组比，三七总皂苷样品1于125 ng/尾浓度下血流速度显著增加（＜0.05），三七总皂苷样品2于62.5 ng/尾浓度下血流速度显著增加（＜0.05），三七总皂苷样品3于125 ng/尾浓度下血流速度显著增加（＜0.05），三七总皂苷样品4于 250 ng/尾浓度下血流速度显著增加（＜0.05）。详见表3和图3。

表3 样品血管内皮损伤性血栓血流动力学改善功效评价实验结果（n＝10）

注与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05。

图3 样品处理后斑马鱼血流速度

注：与正常对照组比，###＜0.001；与模型对照组比，*＜0.05。

4 讨论

血管内皮细胞是一种单层扁平细胞，介于血流与血管壁组织之间，是血管平滑肌和血液的屏障，可合成和释放血管活性物质，调控血管张力，维持血管结构，在血流动力学与血管的收缩舒张功能方面具有不可替代的调控作用，对维持正常的血液循环有重要的生理作用[1]。大量研究数据显示，血管内皮细胞发生损伤及其导致的病理变化是形成血瘀证的重要因由，与多种心血管疾病危险因素有着密切的联系[2]。

斑马鱼能够全面、方便、快捷地检测评估先导药物的初步药效和安全性，进而实现药物的高通量筛选，是目前生命科学研究中最佳模式生物之一[3]。普纳替尼是一种激酶抑制剂，可阻断血管内皮生长因子（VEGF）与其受体的作用，从而干扰血管内皮细胞迁移、存活等正常生理功能而诱发血管内皮发生损伤，导致血管产生堵塞，引起血栓[4]。在斑马鱼躯干出现血栓之后，回心血量随之减少，减小血管直径，降低血流速度，通过血红细胞特异性染色（呈红色），利用斑马鱼血液系统呈透明的独特优势[5,6]，可在显微镜下直接观察心脏红细胞，血管内皮损伤性血栓模型斑马鱼心脏红细胞数量明显少于正常斑马鱼心脏红细胞数量，通过心跳血流分析系统可直接观察采集斑马鱼血流相关数据。

5 结束语

本研究采用普纳替尼致斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型，探讨不同配比三七总皂苷改善血管内皮损伤性血栓功效。研究结果表明，三七总皂苷样品1、三七总皂苷样品2、三七总皂苷样品3和三七总皂苷样品4均可增加血管内皮损伤性血栓模型斑马鱼心脏红细胞数量和提高血流速度，改善斑马鱼血管内皮损伤性血栓，从而发挥活血化瘀的功效。其中在62.5 ng/尾浓度下，三七总皂苷样品2增加斑马鱼心脏红细胞数量和提高血流速度最佳。

[1] 胡小勤. 血瘀证与血管内皮细胞损伤研究进展[J]. 中华中医药杂志，2012，27(1): 153-155.

[2] 胡聿昕，廖俊雅，张志清，等. 血流剪应力对血管内皮细胞的影响及其与血瘀证的关系[J]. 中华中医药杂志，2022，37(7): 3995-3998.

[3] 秦小妹，郭帅杰，李悦，等. 斑马鱼模型在中药心血管药理学研究中的应用[J]. 世界中医药，2021，16(15): 2358-2361.

[4] 张亚楠，孙继红，黄新益，等. 普纳替尼对人血管内皮细胞功能的影响[J]. 药物评价研究，2015，38(2): 156-160.

[5] 陈维武，白玛卓玛，郭胜亚，等. 二十五味珍珠片对斑马鱼微血管功能的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2019(13): 49-54.

[6] 王木兰，潘永明，金敏，等. 斑马鱼血栓模型的建立与冠心宁片的干预作用[J]. 中国实验动物学报，2016，24(4): 432-438.

Study on the Evaluation of the Efficacy of Panax Notoginsenosides in the Treatment of Vascular Endothelial Injury Thrombosis

Objective: To evaluate the effect of Panax notoginsenosides on vascular endothelial injury thrombosis by using the Zebrafish vascular endothelial injury thrombosis model. Methods: Ponatinib was used to establish Zebrafish vascular endothelial injury thrombus model. After being treated with Panax notoginsenosides at the condition of 28℃ for 18 hours, MTD, red blood cell staining intensity and blood flow velocity were measured. Results: The MTD of Panax notoginsenosides sample 1, Panax notoginsenosides sample 3 and Panax notoginsenosides sample 4 to model Zebrafish was 250 ng/tail, and the MTD of Panax notoginsenosides sample 2 to model Zebrafish was 62.5 ng/tail. Panax notoginsenosides can increase the red blood cell staining intensity and blood flow velocity of model Zebrafish heart. Conclusion: The Panax notoginsenosides can improve the thrombotic effect of Zebrafish vascular endothelial injury.

Panax notoginsenosides; vascular endothelial injury; thrombus; efficacy

R743; R285

A

1008-1151(2023)09-0070-04

2023-04-12

中央引导地方科技发展资金项目（桂科ZY22096004）；广西科技基地和人才专项（桂科AD20297068）；梧州市科技计划项目（202202009）。

严灿梅（1990－），女，广西梧州制药（集团）股份有限公司实验师，从事药理研究相关工作。

郑志远（1967－），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司高级工程师，从事药物研究相关工作。