高效液相色谱—蒸发光检测器测定石斛夜光丸的5种成分

李丽莉 白桂昌 罗 轶 覃丽郦 吕轶峰　

高效液相色谱—蒸发光检测器测定石斛夜光丸的5种成分

李丽莉 白桂昌 罗 轶 覃丽郦 吕轶峰

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

目的：建立同时测定石斛夜光丸人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，麸炒枳壳中新橙皮苷、柚皮苷的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱－蒸发光散射法（HPLC-ELSD），流动相为乙腈－水梯度洗脱，空气流速2.0 L/min，漂移管温度为110℃。采用建立的方法对样品进行测定，并使用R语言对结果进行分析。结果：所测5种成分在各自线性范围线性关系良好，相关系数r均大于0.999 6，精密度、重复性、稳定性RSD均小于2.95%，平均回收率为96.7%～99.5%，RSD均小于1.90%。使用R语言对结果进行分析，不同厂家的石斛夜光丸5种成分含量差异显著。结论：该方法简便快捷、稳定，测定结果准确可靠，实现了对石斛夜光丸中麸炒枳壳、人参的质量评价，一方面为进一步提升石斛夜光丸的整体质量控制水平奠定基础，另一方面也为不同厂家石斛夜光丸的质量对比研究提供参考。

石斛夜光丸；麸炒枳壳；人参；R语言；HPLC-ELSD

引言

石斛夜光丸由石斛、人参、山药、茯苓、甘草、肉苁蓉、枸杞子、菟丝子、地黄、熟地黄、五味子、天冬、麦冬、苦杏仁、防风、川芎、麸炒枳壳、黄连、牛膝、菊花、盐蒺藜、青葙子、决明子、水牛角浓缩粉、山羊角等25味药材组成，被收录于《中国药典》2020年版一部[1]，具有滋阴补肾、清肝明目的功效。

本品现行质量标准仅控制了黄连1味药的含量，未对其中贵细药材人参进行含量控制，控制指标不全面。

此外，本品处方中有枳壳药材。枳壳与青皮性状相近[2,3]，但成分上有所不同。青皮中含芸香柚皮苷、橙皮苷，不含柚皮苷、新橙皮苷，枳壳中含柚皮苷、新橙皮苷[4-7]。石斛夜光丸现在标准中采用薄层鉴别的方法，以柚皮苷、新橙皮苷为对照品，对枳壳进行定性控制。采用该方法实验，芸香柚皮苷、橙皮苷（青皮中含有），柚皮苷、新橙皮苷斑点颜色一致（枳壳中含有），Rf值也较为接近，该方法不能有效鉴别石斛夜光丸中投的是枳壳还是青皮，因此建议采用灵敏度、专属性更高的方法对枳壳进行含量控制。

为能更好地反映石斛夜光丸样品的质量，本文采用HPLC- ELSD法建立了石斛夜光丸人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1以及麸炒枳壳中含量较高的新橙皮苷、柚皮苷的含量测定方法[8-10]，为合理评价石斛夜光丸的质量提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 试药与样品

1.1.1 试药

柚皮苷对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110722-201815，含量91.7%）；新橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：11857-201804，含量99.4%）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110703-201933，含量93.4%）；人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110754-202028，含量93.9%）；人参皂苷Rb1对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110704-202028，含量93.1%）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.1.2 样品

57批石斛夜光丸均为水蜜丸，来自9个不同的生产企业。

1.2 仪器

Waterse2695高效液相色谱仪，AllChrom ELSD6000蒸发光散射检测器，ML204型电子分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为CAPCELLPAK MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈－水系统；色谱梯度洗脱：0～25 min、14%乙腈，25～45 min、14%～20%乙腈，45～63 min、20%～24%乙腈，63～70 min、24%～28%乙腈，70～82 min、28%～33%乙腈，82～95 min、33%乙腈，95～102 min、33%～38%乙腈，102～105 min、38%乙腈；流动相流速1.0 mL/min，空气流速2.0 L/min；漂移管温度110℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0.458 0、0.573 0、0.100 2、0.092 2、0.203 5 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备

取样品，研碎，取6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50 mL，蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25 mL，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

分别精密吸取对照品混合溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积对数值为纵坐标()，对照品进样量对数值为横坐标()，计算回归方程，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.4.2 精密度试验

取“2.2”项下的样品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积并计算RSD，RSD分别为2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验

取同一批石斛夜光丸，按“2.3”项下方法各平行制备6份样品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析。新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量分别为0.8598 mg·g-1（RSD=1.79%）、07313 mg·g-1（RSD=2.46%）、0.1854 mg·g-1（RSD=1.44%）、0.3968 mg·g-1（RSD=1.47%）、0.3043 mg·g-1（RSD=0.62%），RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

取“2.2”项下的同一供试品溶液，分别于0、4、8、14、20、24 h，按“2.1”项下色谱条件分析，计算新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积并计算RSD，RSD分别为2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 加样回收实验

称取石斛夜光丸6份，精密称定，计算样品中新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量，以样品含量与对照品加入量1∶1的比例，分别加入对照品，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1回收率分别为99.3%（RSD=1.40%，=6）、96.2%（RSD=0.64%，=6）、99.5%（RSD=1.90%，=6）、96.7%（RSD=1.49%，=6）、96.7%（RSD=1.52%，=6），回收率在95%～100%之间，表明回收率实验符合要求，方法的准确度良好。

2.6 样品测定及结果

取不同厂家、不同批号石斛夜光丸57批，按“2.1”项下色谱条件进行分析，对样品中所含新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1进行测定，结果见表1、表2。其中G、H、I三家企业未检出新橙皮苷、柚皮苷峰，检出其它两个色谱峰，经确认为橙皮苷与云香柚皮苷峰。所有企业均检出人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰，但C企业样品及E、F企业的部分样品人参皂苷Rb1峰含量相对偏高。

表2 57批石斛夜光丸5种成分含量测定结果表

表2（续）

生产企业批号柚皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1人参皂苷Rg1/mg·g-1人参皂苷Re/mg·g-1人参皂苷Rb1/mg·g-1 G190501000.060.160.21 200101000.060.160.25 191001000.040.120.20 H190505000.020.030.06 191006000.100.120.18 191202000.100.220.37 191004000.080.100.16 200104000.080.200.31 191107000.120.330.52 191102000.120.240.38 I191004000.040.100.17

2.7 化学计量分析

本文方法测定采用新橙皮苷、柚皮苷作为枳壳的指标成分，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1作为人参的指标成分，通过测定指标成分的含量评价石斛夜光丸的质量。

应用R语言软件对所测定的结果进行分析。在选择评价因素时，考虑到C企业样品及E、F企业的部分样品人参皂苷Rb1峰含量相对偏高，可能存在以西洋参代替人参投料而出现人参皂苷Rb1峰含量相对偏高的情况[11-16]，故本文采用新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1的含量及人参皂苷Rg1与人参皂苷Re含量的比值来作为评价人参质量的因素[17]。

2.7.1 主成分分析

应用R语言软件以柚皮苷、新橙皮苷、人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg1与人参皂苷Re含量的比值为因素对所测结果进行主成分分析，用“summary”命令得到各主成分得分，见表3。第一主成分的贡献率为73.20%，第二主成分的贡献率为23.94%，累计达到97.14%，说明两者能较全面地反映样品间的差异。

表3 各主成分得分表

使用“tpc”及“cbind”计算各厂家综合得分以及排名，见表4，可以清晰准确比较各厂家产品的质量情况。从表4可以看出，A厂得分最高，排第一。

表4 各厂家综合得分以及排名

2.7.2 聚类分析

使用“biplot”与“plot”命令得到第一、第二主成分相关趋势图与聚类图，见图1、图2，各生产企业大致分为4类：（1）H、G、I未检出柚皮苷与新橙皮苷归为一类；（2）C、F因人参皂苷Rg1与人参皂苷Re比值较低归为一类；（3）A因人参皂苷Rg1含量以及其余与人参皂苷Re含量的比值较高归为一类；（4）其余D、B、E归为一类。

图2 聚类图

3 讨论

3.1 检测器的选择

实验过程中，考察了以乙腈-0.1%磷酸为流动相，使用紫外检测器以203、283 nm为检测波长对样品中新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1进行测定，但因干扰峰较多，使供试品溶液制备过程更加繁琐，且不同厂家产品有所差异，在测定过程中，无法保证待测组分与干扰峰均能得到有效分离。而采用HPLC-ELSD方法测定新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量，与紫外检测器相比，干扰较少，使提取更简单，结果更准确。

笔者曾采用Alltech 3300 ELSD低温型蒸发光散射检测器进行检测，结果灵敏度欠佳。AllChrom ELSD6000高温型蒸发光散射检测器，指标性成分稳定性好，灵敏度高。

3.2 关于测定结果分析

采用建立的方法对9个生产企业57批石斛夜光丸进行检测，并采用R语言和聚类分析方法对检测结果进行分析，发现部分批次样品未检出新橙皮苷、柚皮苷峰，提示部分生产企业未按处方投料。57批石斛夜光丸柚皮苷、新橙皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re与人参皂苷Rb1含量存在差异，表明各生产企业之间5种成分均有显著性差异，各企业对原药材质量控制松紧不一，石斛夜光丸质量好坏参差不齐。

4 结论

本文采用HPLC-ELSD方法测定新橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量，五种成分精密度RSD为1.26%～2.95%，重复性RSD为0.62%～2.46%，24小时稳定性RSD为1.26%～2.92%。所建立的方法操作简单易行，实验结果稳定可靠，专属性和重现性好。为石斛夜光丸中人参与麸炒枳壳的质量控制提供了有效的技术手段。

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Determination of 5 Components in Shihu Yeguang Pills by High Performance Liquid Chromatography with Evaporation Photodetector

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1and the content of new hesperidin and naringin in fructori aurantii. Methods: High performance liquid chromatography evaporative light scattering (HPLC-ELSD) was used. The mobile phase was acetonitrile water gradient elution, with an air flow rate of 2.0 L/min and a drift tube temperature of 110 ℃. The established method was used to measure the samples, and the results were analyzed using R language. Results: The 5 components tested showed good linear relationships within their respective linear ranges, with correlation coefficients r greater than 0.9996. The RSD for precision, repeatability, and stability were all less than 2.95%, with an average recovery rate of 96.7% to 99.5% and RSD less than 1.90%. Using R language to analyze the results, it was found that there were significant differences in the content of the 5 components of Shihu Yeguang pills from different manufacturers. Conclusion: This method is simple, fast, stable, and the determination results are accurate and reliable. It not only achieves the quality evaluation of fructori aurantii and ginseng in Shihu Yeguang pills, but also lays the foundation for further improving the overall quality control level of Shihu Yeguang pills. On the other hand, it also provides reference for the quality comparison research of Shihu Yeguang pills from different manufacturers.

Shihu Yeguang pills; fructori aurantii; ginseng; R language; HPLC-ELSD

O657

A

1008-1151(2023)09-0017-05

2023-02-27

李丽莉（1980－），女，广西壮族自治区食品药品检验所副主任药师，从事中药民族药质量控制研究工作。

吕轶峰（1982－），男，广西壮族自治区食品药品检验所副主任药师，从事中药民族药质量标准研究工作。