肌动蛋白相关蛋白2/3 复合体亚基4、环氧合酶2 在结直肠癌组织中的表达及与患者临床特征和预后的关系

王雷，王越月，牛云霞#

1延安大学咸阳医院病理科，陕西 咸阳 712000

2陕西中医药大学第二附属医院病理科，陕西 咸阳 712000

近年来随着人们生活方式和饮食习惯的改变，中国结直肠癌的发病率逐渐升高，居全部恶性肿瘤第3 位[1]。结直肠癌可采取手术治疗，但仍有不可控的转移导致患者死亡，因此尽早诊断结直肠癌可大大提高患者生存率，延长患者生存期。肌动蛋白相关蛋白2/3（actin related protein 2/3，Arp2/3）是一种肌动蛋白装配成核器，可参与微丝的产生，具有构建细胞骨架、参与细胞运动等功能[2]，其组成成分包括7 种亚基，通过互相作用连接为稳定的Arp2/3[3-4]。有报道指出，下调肌动蛋白相关蛋白2/3 复合体亚基5（actin related protein 2/3 complex subunit 5，ARPC5）的表达可有效抑制肺癌细胞扩散和恶性增殖，但目前关于Arp2/3 主要构成成分肌动蛋白相关蛋白2/3 复合体亚基4（actin related protein 2/3 complex subunit 4，ARPC4）的研究少有报道，ARPC4 与结直肠癌发生发展和预后的关系仍未明确[5-6]。此外，环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）在结直肠癌组织中大多为阳性表达，而在正常组织中为阴性或弱阳性表达，提示COX2 对结直肠癌的预测价值较高。本研究探讨ARPC4 和COX2 在结直肠癌组织中的表达及与患者临床特征和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015 年8 月至2017 年8 月延安大学咸阳医院收治的结直肠癌患者的病历资料。纳入标准：①经病理检查确诊为结直肠癌，且为首次确诊；②未服用过非甾体抗炎药；③临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②术前曾接受过放化疗；③合并多脏器衰竭；④妊娠期女性。依据纳入和排除标准，本研究纳入96 例患者，其中男45例，女51 例；平均年龄（57.18±7.13）岁；直肠癌47例，结肠癌49 例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组织化学染色法检测ARPC4、COX2 表达情况

采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）连结法进行免疫组织化学染色。①烤片。收集结直肠癌组织标本，每例标本切取3 张切片，厚度为3 μm，检查电烤箱是否完好，设置温度为60 ℃，预热完成后，将切片置于烤架上，烘烤30 min。②脱蜡、水化。将烘烤后的切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，拿出后放置5 min，进行脱蜡。然后分别在100%、95%、75%乙醇中浸泡5 min，完成水化。水化后将切片置于流水下清洗，将乙醇洗去，但注意不能用力冲洗。③高压抗原修复。将250 ml 柠檬酸钠溶解于2 L 蒸馏水中，溶解充分后置于高压蒸汽锅中，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽锅出汽后等待2 min，关闭电源，等待切片自然冷却后取出。分2 次浸泡于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫组化笔在病灶组织旁画圈，为将预加试剂固定于切片做准备。然后滴加3%过氧化氢，维持10 min，再用PBS 清洗3 次，甩干。⑤一抗孵育。滴加ARPC4、COX2一抗工作液，于4 ℃冰箱孵育过夜。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。⑥二抗孵育。滴加兔抗人ARPC4、COX2 多克隆抗体，于室温下放置30 min，分3 次浸泡于PBS 中，每次3 min。⑦二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。现用现配DAB 试剂并滴加，等待1 min 后用PBS 清洗3 次。⑧苏木素染色。染色30 s 后自来水冲洗1～2 次，甩干。⑨脱水、封片。将切片依次置于75%、95%、100%乙醇中，每次3 min，然后在组织中央滴一滴中性树脂，封片。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

由3 名经验丰富的病理科医师对染色结果进行判定，意见不统一时协商讨论。ARPC4 主要定位于细胞质，COX2 主要定位于核膜与内质网。采用染色强度和阳性细胞百分比结合的半定量方法进行评分，综合评分=阳性细胞百分比评分×染色强度评分。阳性细胞百分比评分：0%～5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～100%为3分；染色强度评分：未着色为1 分，淡黄色为2 分，深黄色为3 分。综合评分0～1 分为阴性，2～9 分为阳性。

1.4 观察指标

收集患者的临床资料，包括年龄、性别、淋巴结转移情况、肿瘤直径、分化程度、T 分期、TNM 分期，比较不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 阳性表达率，分析结直肠癌组织中ARPC4 与COX2 表达的相关性。所有患者均随访3 年，比较不同ARPC4、COX2 表达情况结直肠癌患者的3 年生存率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用回归分析法进行相关性分析。以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌患者中ARPC4 和COX2 表达情况

结直肠癌患者中ARPC4 阳性表达率为61.46%（59/96），COX2 阳性表达率为59.38%（57/96）。

2.2 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 阳性表达情况的比较

不同年龄、性别、肿瘤直径、T 分期结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；有淋巴结转移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 阳性表达率均高于无淋巴结转移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同临床特征结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 表达情况的比较

2.3 结直肠癌组织中ARPC4与COX2表达的相关性

结直肠癌组织中ARPC4 与COX2 的表达呈正相关（r=0.618，P﹤0.05）。

2.4 生存情况的比较

ARPC4阳性表达结直肠癌患者的3年生存率为30.51%（18/59），低于ARPC4阴性表达患者的54.05%（20/37），差异有统计学意义（χ2=5.272，P=0.022）。COX2 阳性表达结直肠癌患者的3 年生存率为29.82%（17/57），低于COX2阴性表达患者的51.28%（20/39），差异有统计学意义（χ2=4.501，P=0.034）。

3 讨论

在中国，随着人们饮食习惯和环境的改变，结直肠癌的发病率不断上升。国家癌症中心统计数据显示，2020 年结直肠癌新发病例45.6 万例，其发病率居全部恶性肿瘤第2 位[7]。研究显示，结直肠癌一旦发生转移，即使经手术切除，依然容易复发[8-9]。接受过结直肠癌切除术的患者可能会发展为异时性结直肠癌。因此，早期筛查和预后评估对延长结直肠癌患者生存期具有重要意义，精准快捷的检测手段可指导医师判断病情，从而制订更规范的诊疗计划，为患者争取最佳治疗机会。

ARPC 蛋白由7 个亚基组成，各亚基通过相互作用形成“C 型”的钳形结构[10-11]，该蛋白具有3 个带有极性基团的线性表位，抗原决定簇存在于ARPC 蛋白表面位置，易与相应抗体特异性结合，影响抗原抗体的结合能力[12-13]。ARPC 可影响肿瘤细胞和细胞外基质的运动能力，为恶性肿瘤的浸润和转移奠定基础。ARPC 可通过磷酸化来发挥其生物学活性，磷酸化降低了ARPC 蛋白的稳定性，进而使其发挥作用。ARPC 可降低p53 的活性，抑制BCL2 相关X 蛋白（BCL2 associated X protein，BAX）转录，从而降低细胞膜的选择透过性，继而改变细胞周期和增殖能力，影响细胞凋亡过程，促进细胞增殖。本研究结果显示，ARPC4阳性表达结直肠癌患者的3 年生存率低于ARPC4 阴性表达患者（P﹤0.05）。说明ARPC4对结直肠癌的发生发展具有重要作用，ARPC4高表达与肿瘤细胞免疫逃逸息息相关，ARPC4 可促进肿瘤细胞种植，缩短患者生存期。也有报道指出，ARPC4 可通过调控膀胱癌、肺癌、肝细胞癌侵袭转移影响患者预后[14-15]。

内皮细胞之间的黏附功能对维持正常生命活动十分重要，肌动蛋白微丝骨架可以使内皮细胞之间紧密连接，即形成屏障功能。联蛋白（catenin）和钙黏着蛋白（cadherin）结合形成复合体后，维持了屏障功能的正常运行。有学者指出，ARPC4 可干扰catenin 与cadherin 结合，加速细胞周期，并正向调节肿瘤细胞中侵袭基因转录，造成细胞质内catenin 浓度升高并进入细胞核，加速肿瘤细胞的种植[16]。同时，ARPC4 作为Arp2/3 中心的重要组成部分，可增加微丝的数量，增强肿瘤细胞的侵袭性。也有报道指出，ARPC4 可对靶细胞进行双向调节，通过抑制黑色素瘤中APRC4 的表达减缓肿瘤的侵袭速度，但其表达被明显抑制后却没有这一效应[17]。

COX2 是一类参与前列腺素合成的限速酶，可被生长因子等物质刺激合成[18]。COX2 可在肿瘤中参与前列腺素合成，继而促进肿瘤的发生发展，有学者在结肠癌转移灶中发现COX2 呈高表达，且其表达活性明显高于原发灶，证实COX2 对肿瘤侵袭具有促进作用，会提高结肠癌的复发风险[19]。有学者进行动物实验后发现，定期服用COX2 抑制剂可使小鼠结肠息肉发生率降低40%，异常隐窝病灶发生率降低67%，表明COX2 抑制剂可预防结直肠疾病[20]。本研究中，有淋巴结转移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者结直肠癌组织中ARPC4、COX2 阳性表达率均高于无淋巴结转移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。提示ARPC4、COX2与结直肠癌患者的临床特征密切相关。

WNT 信号通路中，ARPC4 可导致细胞质内catenin 大量聚集并入核，大大增强了catenin 与转录因子（transcription factor，TCF）/淋巴细胞增强结合因子1（lymphoid enhancer binding factor 1，LEF1）的结合能力，促进WNT 下游靶基因的表达。COX2可与TCF 结合，是众多WNT 下游靶基因之一，catenin 的浓度变化可影响COX2 的表达。本研究结果显示，结直肠癌组织中ARPC4 与COX2 的表达呈正相关（r=0.618，P﹤0.05）。分析可能因为ARPC4 高表达是catenin 浓度异常的诱因，而catenin 浓度增加可促进COX2 表达，进而促进肿瘤的发生发展。因此认为ARPC4 高表达→大量catenin 聚集→catenin 与TCF/LEF1 结合→上调COX2 表达→激活前列腺素→致癌，ARPC4 异常表达会导致COX2无法正常转录，进而导致癌变。

综上所述，结直肠癌组织中ARPC4 与COX2的表达呈正相关，其表达与结直肠癌患者的临床特征及预后有关。