NOD 样受体家族含CARD 结构域5 在胃癌中的相互作用蛋白及其对胃癌的诊断价值△

吴杨，张小敏，郑少华

定州市人民医院1肿瘤内科，2消化内科，河北 定州 073000

NOD 样受体家族含CARD 结构域5（NOD-like receptor family CARD domain containing 5，NLRC5）的表达抑制可以显著增强脂基糖（liposaccharide，LPS）刺激下核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的活性以及细胞因子的表达量，而其自身也是NF-κB 通路的产物，被LPS 活化的NF-κB可以上调NLRC5 的表达，从而形成一个负反馈环，对NF-κB 活性进行更精细的调控[1-3]。胃癌发生的影响因素较多，包括遗传因素、地域饮食文化因素、环境因素等，胃黏膜感染后产生的多种炎性因子可以激活NF-κB 通路，进而使多种细胞趋化因子上调，在胃癌的发展中发挥重要的作用[4]。虽然NLRC5 是NF-κB 信号通路的上游因子，但是否还有其他生物学通路参与NLRC5 的表达，目前无较多的研究报道。因此本研究应用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库和基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库探究与NLRC5 相关的调控通路，明确其在胃癌中的诊断价值和生物学特性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 生物信息分析（数据获取与预处理）

TCGA（https://www.genome.gov/Funded- Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas）数据库是由美国国家癌症研究所设立的肿瘤样本数据库，旨在通过基因组分析寻找肿瘤相关的基因变异。根据本研究要求，利用“TCGAbiolinks”包下载TCGA 中胃癌样本，细胞学分类只选择腺癌样本，防止由于细胞学分类不同带来的影响，最终纳入377 例肿瘤组织样本和34 例癌旁组织样本。

GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由美国国家生物技术信息中心建立并管理的生物信息公共数据库。GEO 数据库是全球最大且免费开放的数据库，包含了各国科研人员收集上传的测序数据和芯片数据，其涵盖的疾病范围不仅包含肿瘤疾病也包含非肿瘤疾病，物种从智人、小鼠、果蝇等扩展到微生物，是生物信息学研究的重要数据来源。根据本研究要求收集胃腺癌样本数据集，最终锁定数据集为GSE213324，数据集中包含63 例肿瘤组织样本和60 例癌旁组织样本。

本研究为了探讨NLRC5基因对胃癌患者生存情况的影响，以TCGA 为发现集、GEO 为验证集来评估NLRC5 在胃癌患者中的生物学作用。采用Wilcoxon 秩和检验比较NLRC5 在胃癌组织及癌旁组织间的表达差异，同时利用“limma”包筛选组间差异表达基因。利用“clusterProfiler”包对关键基因分别进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，均以P﹤0.05 为判别标准筛选有意义的生物学途径。以NLRC5 为研究中心，将其他基因分别与NLRC5 进行Pearson相关性分析来筛选与NLRC5 在表达量上存在协同变化的基因。若无特殊说明，利用R 软件中的“ggplot2”对上述数据结果进行可视化展示。

1.2 一般资料

收集2020 年3 月至2022 年11 月于定州市人民医院就诊的胃癌患者的病历资料。纳入标准：①经影像学和病理学检查确诊为胃癌；②在定州市人民医院就诊及治疗；③未接受过放化疗、免疫治疗；④临床资料和随访资料完整。排除标准：①患有严重心脑血管疾病；②严重肝肾功能不全；③合并其他恶性肿瘤；④合并免疫系统或血液系统疾病。根据纳入、排除标准，共纳入60 例胃癌患者，男性48 例，女性12 例；平均年龄（68.09±7.15）岁；TNM 分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期6例。取60 例胃癌患者的60 例胃癌组织和60 例癌旁组织。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 胃癌组织与癌旁组织的采集和处理 将病理检查取样的组织样本分为两部分，一部分在取样后进行石蜡处理保存，一部分进行组织匀浆制备，置于-20 ℃下保存。

1.3.2 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测核因子κB 激酶复合物抑制剂组分（component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex，CHUK）、核因子κB 激酶亚单位β的抑制剂（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta，IKBKB）在不同组织中的相对表达量 CHUK 蛋白检测采用武汉云克隆科技股份有限公司保守螺旋环螺旋广泛存在激酶（CHUK）检测试剂盒。IKBKB 蛋白检测采用武汉伊艾博科技股份有限公司核因子κB抑制蛋白激酶亚基β检测试剂盒。使用制备好的胃癌组织以及癌旁组织匀浆根据试剂盒的说明书进行检测。

1.3.3 免疫组化法检测三重基序蛋白25（tripartite motif containing 25，TRIM25）、NLRC5 表达情况胃癌组织及癌旁组织石蜡块进行4 μm 切片，运用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-peroxidase，SP）法检测胃癌组织和癌旁组织中NLRC5、TRIM25 的表达情况，具体步骤根据SP 试剂盒进行操作。免疫组化结果由两位副主任医师及以上职称的病理科医师双盲阅片，独立评分。依据切片中阳性细胞所占比例和染色强度进行评分。染色强度：无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0 分，1%≤阳性细胞所占比例﹤25%为1分，25%≤阳性细胞所占比例﹤50%为2 分，50%≤阳性细胞所占比例﹤75%为3 分，阳性细胞所占比例≥75%为4 分。将两项得分相乘：0～3 分定义为“-”，4～5 分为“+”，6～7 分为“++”，≥8 分为“+++”；0～5 分为阴性，≥6 分为阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，评价TRIM25、IKBKB、CHUK、NLRC5 对胃癌的诊断价值；采用散点图评估TRIM25、IKBKB、CHUK 与NLRC5 的相关性；以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选NLRC5相关差异表达基因并进行富集分析

在TCGA 数据集中采用Wilcoxon 秩和检验比较NLRC5 在胃癌组织及癌旁组织间的表达差异，结果显示，胃癌组织中NLRC5 表达水平明显高于癌旁组织[（0.123±0.011）vs（0.008±0.003），P﹤0.01）]。组间差异基因分析以P﹤0.05 且|log2FC|﹥0.11 为标准共筛选出4466 个差异表达基因。将基因谱中的全部基因分别与NLRC5 进行关联分析并进行富集分析，GO 富集分析结果显示，生物学途径中mRNA 和DNA 过程高度富集。KEGG 富集分析结果显示，核质运输和细胞周期也被高度富集（图1）。因此得到NLRC5 涉及的相关显著基因在胃癌发生发展过程中主要参与基因合成、mRNA相关功能。

图1 GO富集分析和KEGG富集分析

2.2 构建蛋白-蛋白相互作用网络

利用STRING 网站确定NLRC5 相互作用蛋白，根据蛋白-蛋白相互作用网络可知，NLRC5 一共有29 条生物学关联，共10 个基因与NLRC5有生物学相互作用。将这10个基因与TCGA数据库筛选到的4466 个基因取交集，结果发现共有3 个基因，分别为TRIM25、CHUK、IKBKB，TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 有生物学相互作用。胃癌组织与癌旁组织中TRIM25、CHUK、IKBKB 表达情况比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05）（图2）。Pearson 相关分析结果显示，TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 均呈正相关（P﹤0.01）（图3）。

图2 胃癌组织和癌旁组织中TRIM25、CHUK和IKBKB表达情况的比较

图3 TRIM25、CHUK、IKBKB与NLRC5的相关性散点图

2.3 GEO 数据集验证结果

从GEO 数据集下载GSE213324 数据集来验证TCGA 数据集筛选到的3 个基因。胃癌组织中TRIM25、IKBKB 和NLRC5 表达水平均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）；胃癌组织和癌旁组织中CHUK 表达水平比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）（图4）。利用TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 构建联合诊断模型，绘制ROC 曲线量化联合模型的诊断效能，结果显示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 联合检测对胃癌具有较高诊断价值（曲线下面积=0.920，95%CI：0.870～0.970）（图5）。

图4 GEO数据集中胃癌组织和癌旁组织中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5表达情况的比较

2.4 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 表达情况的比较

免疫组化结果显示，NLRC5 在60 例胃癌组织中的阳性表达率为95.00%（57/60），阴性表达率为5.00%（3/60），在癌旁组织中的阳性表达率为41.67%（25/60），阴性表达率为58.33%（35/60）。TRIM25 在60 例胃癌组织中的阳性表达率为81.67%（49/60），阴性表达率为18.33%（11/60），在癌旁组织中的阳性表达率为41.67%（25/60），阴性表达率为58.33%（35/60）。胃癌组织中NLRC5、TRIM25 免疫组化评分均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。ELISA 检测结果显示，胃癌组织中CHUK、IKBKB 表达水平均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1、图6）

表1 胃癌组织和癌旁组织中IKBKB、CHUK、TRIM25、NLRC5 表达情况的比较

图6 胃癌组织和癌旁组织中NLRC5和TRIM25表达情况（免疫组化染色，×400）

2.5 临床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 的相关性分析

Pearson 相关分析结果显示，TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 均呈正相关（P﹤0.01）。（图7）

图7 临床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB与NLRC5的相关性散点图

2.6 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 联合检测对胃癌的诊断效能分析

ROC 曲线显示，NLRC5[曲线下面积为0.872（95%CI：0.809～0.935）]诊断胃癌的效能优于TRIM25[ 曲线下面积为0.783（95%CI：0.697～0.869）]、CHUK[曲线下面积为0.755（95%CI：0.667～0.843）]、IKBKB[曲线下面积为0.771（95%CI：0.681～0.860）]。TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5联合检测[曲线下面积为0.946（95%CI：0.909～0.983）]诊断胃癌的效能优于各项指标单独检测，说明联合模型对于胃癌具有良好的诊断效能，其中贡献度最高的是NLRC5。（图8）

图8 临床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5单独及联合检测诊断胃癌的ROC曲线

3 讨论

NLRC5 是主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ）类基因和参与MHCⅠ类抗原呈递途径的其他基因转录激活的关键调控因子。MHCⅠ类反式激活因子（MHC class Ⅰtransactivator，CITA）/NLRC5通过募集和激活杀死肿瘤的CD8+T细胞，在人类肿瘤免疫中起着至关重要的作用[5-6]。作为NLR 家族中的成员，NLRC5可通过调控炎性反应维持机体的稳定，而肿瘤的发生与炎性反应存在显著关系[7-8]。有研究显示，NLRC5基因多态性与胃癌的发病风险、TNM 分期、预后存在直接关联[9]。徐徽等[10]研究也提示，NLRC5高表达是影响胃癌患者预后的危险因素，其研究重点在于NLRC5 与患者预后的关系以及胃癌细胞生物学，并未对NLRC5在胃癌诊断中的价值进行分析。已有研究表明，NLRC5 作为NF-κB 的上游因子可结合NF-κB 通路中的关键激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，抑制NF-κB 通路的活化[11-12]。而蛋白存在多条调控通路，直接或者间接参与疾病的发展，探究是否还存在其他与NLRC5 相关的蛋白，共同调节NF-κB 的表达，来参与胃癌的发生或发展在临床工作中至关重要，可为临床中胃癌诊断与治疗提供新的方向。

本研究通过采用TCGA 数据库探究NLRC5 在胃癌组织和癌旁组织中的差异，结合STRING 网站分析NLRC5 的相互作用蛋白，通过GEO 数据库验证TCGA 数据集筛选出来的蛋白对胃癌的诊断价值，结果显示，与NLRC5 互关作用的蛋白为TRIM25、CHUK、IKBKB，联合诊断模型对胃癌具有较高的诊断价值。IKBKB编码的蛋白质磷酸化抑制剂/NF-κB 复合物中的抑制剂，导致抑制剂解离和NF-κB 激活[13]。而NLRC5 主要作用于NF-κB通路中的关键激酶IKKα/β 并抑制其磷酸化。CHUK基因编码的复合物IKKα是NF-κB 信号通路必要的调节器之一[14-15]。NLRC5 负调控NF-κB 通路的机制在于结合通路中的关键激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，当磷酸化位点不能通过泛素化途径触发抑制剂的降解，则转录因子激活失败。NF-κB通路活化失调后，NLRC5 负调控NF-κB 通路进而降低通路活化数量。CHUK 磷酸化通过泛素化途径触发抑制剂降解的位点，从而激活转录因子，而TRIM25 作为泛素E3 连接酶发挥作用，参与多种细胞过程，包括抗病毒先天免疫的调节[16]。综上所述，TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 在胃癌发展中存在直接或者间接相互作用的机制通路。

研究显示，IKBKB 参与胃癌的发生、发展，并且IKBKB 高表达胃癌患者生存率和无病生存率均显著低于IKBKB 低表达胃癌患者[17]，提示IKBKB有可能成为胃癌临床诊断的新靶标，但未有此方面的研究。TRIM25 能影响胃癌细胞的迁移和侵袭，在胃癌发生和发展中起到重要作用[18]。而针对CHUK 的研究较少，目前在肿瘤方面尤其是胃癌处于空白。本研究通过引用临床胃癌模型来验证生物信息学筛选出来的相关作用蛋白，结果显示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 均在胃癌组织中高表达，且TRIM25、CHUK、IKBKB 与NLRC5 的表达均呈正相关，证实TRIM25、CHUK、IKBKB 是NLRC5 的相互作用蛋白。最后通过建立联合诊断模型，绘制ROC 曲线量化联合模型的诊断效能，结果显示曲线下面积为0.946，95%CI 为0.909～0.983，说明TRIM25、CHUK、IKBKB 及NLRC5 联合检测对胃癌具有较高的诊断价值。

综上所述，NLRC5 通过抑制TRIM25 的表达来降低对CHUK 产物IKKα的降解位点的触发，减少NF-κB 的激活，而IKBKB 通过降解NLRC5 来增强NF-κB 的激活。NLRC5 高表达导致IKBKB 的直接性高表达，定向降解NLRC5 对NF-κB 激活抑制，因此探究抑制IKBKB 的表达，对NLRC5 在肿瘤发展中的作用至关重要。本研究的不足在于临床验证模型样本量较少，没有纳入遗传因素和地域饮食文化等因素，在后续的研究中需要继续扩大样本量，进行5 年的随访观察。