黑色素瘤相关抗原3、zeste 2 多梳抑制复合物2 亚基增强子在宫颈癌组织中的表达及与患者预后的关系

牛云霞，王越月，王雷

1陕西中医药大学第二附属医院病理科，陕西 咸阳 712000

2延安大学咸阳医院病理科，陕西 咸阳 712000

宫颈癌是全球第三大女性生殖系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率。目前，晚期宫颈癌患者的中位生存期仅16 个月，严重影响患者的预后[1]。因此，晚期宫颈癌患者的治疗重点是改善患者的预后，抑制肿瘤细胞的进一步侵袭、转移。免疫治疗是近年来新兴的研究热点之一，创伤小，易被医师和患者接受。免疫靶点需要具有较高的特异性，即在正常组织中呈阴性或弱阳性表达，在肿瘤组织中呈阳性表达，从而避免治疗后产生自身免疫性疾病[2]。随着分子生物学的不断发展完善，人们逐渐意识到宫颈癌是由多基因参与的癌变，因此，了解宫颈癌特异性抗原对肿瘤的监测、判断至关重要，可为掌握肿瘤精准治疗奠定基础。研究发现，下调黑色素瘤相关抗原3（melanoma-associated antigen 3，MAGEA3）的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭，表明MAGEA3 可促进肿瘤细胞的生长[3-4]。目前临床已开展关于MAGEA3 免疫治疗的临床试验，但仅局限在肺癌、膀胱癌等患者，对宫颈癌的研究较少。此外，zeste 2 多梳抑制复合物2 亚基增强子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）也被证实可增强肺癌细胞的增殖和转移能力，但对宫颈癌发生发展的作用及与患者预后的关系仍未能完全明确。因此，本研究探讨MAGEA3、EZH2 在宫颈癌组织中的表达及与患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年5 月至2016 年5 月陕西中医药大学第二附属医院收治的宫颈癌患者。纳入标准：①符合《宫颈癌磁共振检查及诊断规范专家共识》[5]中宫颈癌的诊断标准；②精神状态良好；③既往未接受手术或化疗；④病历资料完整。排除标准：①继发性宫颈癌；②随访资料不完整；③语言认知功能障碍，无正常沟通能力。依据纳入和排除标准，本研究共纳入45 例宫颈癌患者，年龄30～67 岁，平均（47.92±5.16）岁。选取同期陕西中医药大学第二附属医院收治的18 例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和17 例健康体检者。CIN 患者年龄31～66 岁，平均（46.89±5.31）岁。健康体检者年龄29～65岁，平均（47.43±4.92）岁。宫颈癌患者、CIN患者、健康体检者年龄比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组化法检测MAGEA3、EZH2 的表达情况

取宫颈癌患者的宫颈癌组织、CIN 患者的CIN组织和健康体检者的正常宫颈组织，切片、脱蜡、水化后，以0.01 mmol/L 枸橼酸盐溶液进行抗原修复13 min，冷却至室温后，滴加少量过氧化氢，以灭活过氧化物酶活性，山羊血清封闭，于室温下孵育20 min，并用滤纸将表面残余水分擦除。滴加一抗EZH2 多克隆抗体、MAGEA3 多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，梯度乙醇脱水，苏木精复染，中性树脂封片，显微镜下观察。

结果判定：MAGEA3、EZH2 主要定位于细胞核，依据染色强度和阳性细胞所占比例进行评分。无着色计0分，淡黄色染色计1分，棕色染色计2分，棕褐色染色计3 分；阳性细胞所占比例﹤25%计0分，阳性细胞所占比例25%～50%计1 分，阳性细胞所占比例51%～75%计2 分，阳性细胞所占比例﹥75%计3分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，﹤3分判定为阴性，≥3分判定为阳性。

1.3 随访方法

采用电话或微信等方式对宫颈癌患者进行为期3 年的随访，随访时间截至2019 年5 月，记录患者的生存情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对所有数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；MAGEA3、EZH2 表达的相关性采用Spearman 相关分析；宫颈癌患者预后的影响因素采用多因素Logistic 回归分析；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAGEA3、EZH2 表达情况的比较

宫颈癌组织、CIN 组织和正常宫颈组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P﹤0.01），宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率均高于正常宫颈组织和CIN 组织，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

表1 宫颈癌组织、CIN 组织和正常宫颈组织中MAGEA3、EZH2 表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征宫颈癌患者MAGEA3、EZH2 表达情况的比较

不同年龄、绝经状态、肿瘤直径、病理类型宫颈癌患者宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；淋巴结转移、肌层浸润深度﹥1/2、临床分期为ⅡA 期、组织学分级为G3级宫颈癌患者宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率分别高于无淋巴结转移、肌层浸润深度≤1/2、临床分期为Ⅰ期、组织学分级为G1～2级的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同临床特征宫颈癌患者MAGEA3、EZH2 表达情况的比较

2.3 宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 表达的相关性

宫颈癌组织中MAGEA3 的表达与EZH2 的表达呈正相关（r=0.337，P﹤0.05）。

2.4 预后情况的比较

MAGEA3 阳性表达宫颈癌患者的3 年生存率为37.14%（13/35），低于阴性表达患者的80.00%（8/10），差异有统计学意义（χ2=4.147，P=0.042）；EZH2 阳性表达宫颈癌患者的3 年生存率为37.84%（14/37），低于阴性表达患者的75.00%（6/8），差异有统计学意义（χ2=4.679，P=0.031）。

2.5 宫颈癌患者预后影响因素的多因素分析

将2.2 中差异有统计学意义的淋巴结转移情况、肌层浸润深度、组织学分级、临床分期作为自变量，宫颈癌患者的预后作为因变量，纳入多因素Logistic 回归分析，结果显示，淋巴结转移、肌层浸润深度﹥1/2、临床分期为ⅡA 期、组织学分级为G3级均是宫颈癌患者预后的独立危险因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 宫颈癌患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起，HPV 是一种可引起组织异常增生的小DNA 病毒，可在多种基因的作用下导致宫颈癌发生，且该过程漫长、复杂[6-7]。近年来，HPV 疫苗、宫颈癌的诊断已取得较大突破，临床宫颈癌的治疗主要采用手术、化疗、放疗或系统综合治疗。早期宫颈癌患者的治疗效果较好，但对于持续性、晚期或复发性宫颈癌的治疗效果较差。靶向治疗作为一种新兴的治疗方式，可同时抑制多个癌基因的表达，具有高效、低毒的优势，为免疫治疗的发展开创了一条新道路[8-9]。此外，研发新的诊断手段、治疗策略，对改善宫颈癌患者的预后有重要意义。

张晶晶等[10]对97 例宫颈癌患者的宫颈癌组织进行分析发现，MAGEA3 表达上调与肿瘤的发生发展有关。陈茜等[11]通过敲除人宫颈鳞状细胞癌SiHa 细胞系中EZH2的表达发现，宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力显著减弱。本研究结果显示，宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率均高于正常宫颈组织和CIN 组织（P﹤0.05），这可能与以下4个方面有关：①EZH2 可促进血管内皮生长因子分泌，从而改变微血管性质和密度，促进肿瘤的发生发展。②EZH2 可促进肿瘤生长因子Ki-67 的表达，从而促进肿瘤细胞转移。③MAGEA3 可与p53结合，降低血细胞中p53 水平，从而使宫颈癌细胞更加活跃。④MAGEA3作为凋亡抑制基因，可降低肿瘤细胞凋亡率[12-13]。EZH2 在中枢神经系统中发挥监控发育调节因子的作用，纠正其不当表达，可确保神经系统发育正常。研究认为，EZH2是癌基因，可促进肿瘤的发生发展[14-15]，MAGEA3在多种肿瘤中发挥癌基因作用，MAGEA3 的表达情况可能影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡等生物学行为[16-17]。

本研究结果显示，淋巴结转移、肌层浸润深度﹥1/2、临床分期为ⅡA 期、组织学分级为G3级宫颈癌患者宫颈癌组织中MAGEA3、EZH2 的阳性表达率分别高于无淋巴结转移、肌层浸润深度≤1/2、临床分期为Ⅰ期、组织学分级为G1～2级的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2均与肿瘤细胞的侵袭、转移有关。研究显示，肿瘤组织必须具备血管生成的条件，才可成功进行侵袭和转移[18]。在肺癌、膀胱癌等肿瘤组织中，EZH2阳性表达率越高，肿瘤组织的新生血管网越丰富，说明EZH2过表达与肿瘤细胞的恶性生长和血管密度有关，是一种肿瘤微血管生成刺激因子[19]。

本研究结果中，宫颈癌组织中MAGEA3 的表达与EZH2 的表达呈正相关（r=0.337，P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2 在肿瘤的发生发展中发挥了协同作用，通过共同建立新生血管网，增强了肿瘤细胞的侵袭和转移能力，同样的结论也适用于卵巢癌、胃癌等。李青等[20]研究显示，沉默MAGEA3基因的表达可抑制宫颈细胞的恶变潜能，其作用可能涉及上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路的激活。成纤维细胞生长因子受体是首个被发现的促微血管生成因子，研究表明，MAGEA3 参与了成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）信号通路的构成[21]。MAGEA3 可促进肿瘤组织中FGRF2 的表达，使肿瘤微血管生成活跃，并通过调节纤维连接蛋白，参与肿瘤细胞的侵袭过程。虽然MAGEA3 及FGRF2 均通过影响肿瘤微新生血管生成来促进肿瘤细胞的持续生长和侵袭转移，但具体机制仍未明确，仍需进一步探讨。

未来的研究可进一步关注MAGEA3、EZH2 表达对淋巴结转移的预测价值，为宫颈癌的临床监测提供帮助。细胞表面包围的MAGEA3 抗原，主要经组织相溶性复合体辨别结合，产生复合物后被宫颈癌细胞识别，进而提高肿瘤细胞的增殖能力；EZH2则通过参与DNA 甲基化抑制抑癌基因转录，二者在免疫疗法治疗宫颈癌中应用前景广阔。本研究结果显示，MAGEA3、EZH2 阳性表达宫颈癌患者的3 年生存率均低于阴性表达患者，提示MAGEA3、EZH2 检测可为复发风险的预测提供有价值的信息。

综上所述，MAGEA3、EZH2在宫颈癌组织中表达上调，且阳性表达患者预后较差，淋巴结转移、肌层浸润深度﹥1/2、临床分期为ⅡA 期、组织学分级为G3级均是宫颈癌患者预后的独立危险因素。