右美托咪定预处理通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对心肌缺血再灌注大鼠心脏损伤和心肌组织自噬的影响

王伊凡,李思远,张 姣

(1.西安交通大学第二附属医院麻醉科,陕西 西安 710004;2.咸阳市第一人民医院麻醉科,陕西 咸阳 712099;3.西安国际医学中心医院麻醉与舒适化医疗中心,陕西 西安 710100;4.咸阳市中心医院麻醉科,陕西 咸阳 712099)

心肌缺血是一种病理生理状态,由冠状动脉狭窄、心肌供血供氧不足引起,可能导致心肌梗死,致使心肌代谢出现障碍和不可逆损伤,因此,尽快恢复心肌缺血区域的血液供应是临床常见的治疗手段[1]。但再灌注恢复血流供应时,产生大量氧自由基,造成组织细胞损伤、坏死或凋亡,因而如何避免再灌注损伤成为治疗的关键[2]。有研究发现,心肌缺血再灌注损伤的发生与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及自噬等相关,其中细胞过度自噬可导致心肌细胞凋亡,是造成心肌损伤的主要原因,或可成为临床治疗的新靶点[3]。右美托咪定作为α2受体激动剂,能够清除氧自由基、调节细胞凋亡等,起到抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用,从而保护器官组织,减轻缺血再灌注损伤[4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路参与细胞增殖与凋亡自噬的调控过程,Akt磷酸化激活后可上调下游信号分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达,进而抑制细胞凋亡、促进细胞增殖,但目前关于右美托咪定与PI3K/Akt/mTOR信号通路之间的作用机制尚不清楚[5]。因此,本研究重点探讨右美托咪定预处理通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对心肌缺血再灌注大鼠心脏损伤和心肌组织自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取60只雄性SD大鼠,8周龄,体质量200～240 g,室温保持在25 ℃上下、相对湿度40%～70%,提供饲料和饮水,由专业人员负责饲养。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药方法:适应性饲养7 d后随机分为假手术组(n=20)、心肌缺血再灌注组(n=20)、右美托咪定预处理组(n=20),建立心肌缺血再灌注损伤模型。大鼠术前12 h禁食不禁水,经腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg实施麻醉,成功后将大鼠以俯卧位固定在操作台上,连接动物心电图仪(秦皇岛市康泰医学系统有限公司,TLC 9803型),监测手术期间大鼠的心电图变化,气管插管后连接小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司,ALC-V8型),潮气量6～8 ml/kg,通气频率60～80次/min,呼吸比1∶2。分离右侧颈总动脉,将聚乙烯导管经右侧颈总动脉缓慢插入左心室,于左侧第3肋间剪断肋间肌,暴露心脏,于左心耳下缘2 mm处,用6-0缝线进针穿过冠状动脉左降支下方的心肌表层,留置硅胶管后结扎,伤口处覆盖湿纱布。心肌缺血成功的标准:左心室前壁及心尖周围心肌组织颜色发绀,心电图ST段抬高超过0.2 mV。持续缺血30 min后松开结扎线,恢复冠状动脉血流。再灌注成功的标准:缺血区域局部颜色变红,心电图ST段恢复正常。

假手术组仅接受假手术,开胸腔暴露心脏后穿针留线而不结扎,不造成心肌缺血。右美托咪定预处理组经颈静脉输注盐酸右美托咪定注射液(国药准字H20213633,规格:2 ml∶0.2 mg),先以1 μg/(kg·h)速度持续泵注10 min,再以0.5 μg/(kg·h)速度继续泵注15 min。假手术组、心肌缺血再灌注组予以等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 仪器与试剂:实时荧光定量PCR仪:赛默飞世尔科技公司,型号:PikoReal 96。由上海生物技术工程公司、北京索莱宝生物技术有限公司购入相关试剂盒,包括肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、HE、Trizol、髓过氧化物酶(Myeloperoxidasedeficiency,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)、白介素-6(Interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

1.2.3 心脏损伤、心肌细胞自噬、PI3K/Akt/mTOR表达、氧化应激及炎症指标检测

1.2.3.1 心脏损伤:再灌注结束后,采集各组大鼠颈部血液标本5 ml,经4000 r/min离心8 min,取上清液,在酶联免疫吸附试验法中测定血清CK-MB、LDH水平,严格按照相关试剂盒说明书进行操作。处死大鼠后,将心脏用0.9%氯化钠溶液充分洗涤,放置于-20 ℃环境下冷冻10 min,沿垂直心脏纵轴方向将其切成2 mm厚的薄片,置入1%TTC磷酸盐缓冲液中,37 ℃水浴箱中避光孵育10 min,置于10%甲醛液中固定。正常心肌组织呈暗红色,心肌梗死组织呈淡白色,应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算心肌梗死面积百分比。

1.2.3.2 心肌细胞自噬:运用Western blot法测定心肌组织中LC3、Beclin、P62蛋白表达,取大鼠心肌组织,置于液氮中碾碎,加入全细胞裂解液,于冰上裂解30 min,提取组织蛋白,应用BCA法测定蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液和0.9%氯化钠溶液配平后,将蛋白样品煮沸5 min,取等量蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭,加入一抗(1∶1000)4 ℃环境下孵育过夜,37 ℃环境下与相应二抗孵育2 h,ECL法显色,应用Quantity One 2.6.2图像分析系统分析蛋白条带灰度值。

1.2.3.3 PI3K/Akt/mTOR表达:应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定大鼠PI3K/Akt/mTOR表达:取大鼠心肌组织50 mg,给予10%中性甲醛固定,石蜡包埋、切片,HE染色,观察组织病理形态变化,放入-80 ℃液氮中冻存备用。采用Trizol试剂提取总RNA,待标本鉴定合格后,行逆转录,严格按照试剂盒说明书进行操作。qRT-PCR条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共进行35个循环。应用2-ΔΔCt法计算PI3K/Akt/mTOR mRNA表达量。

1.2.3.4 氧化应激指标:血液采集、血清制备方法同上,运用酶联免疫吸附试验法测定MPO、SOD、MDA水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3.5 炎症指标:血液采集、血清制备方法同上述操作,采用酶联免疫吸附试验法测定血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平,严格按照相关试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1 各组大鼠心脏损伤比较 与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组血清CK-MB、LDH水平依次升高,且右美托咪定预处理组心肌梗死面积百分比明显小于心肌缺血再灌注组,组间比较差异有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠心脏损伤比较

2.2 各组大鼠心肌细胞自噬比较 与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组心肌组织中LC3、Beclin、P62蛋白表达依次升高(均P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞自噬比较

2.3 各组大鼠PI3K/Akt/mTOR表达比较 与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组心肌组织中PI3K/Akt/mTOR表达依次下降(均P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠PI3K/Akt/mTOR表达比较

2.4 各组大鼠氧化应激指标比较 与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组血清MPO、MDA水平逐渐上升,而血清SOD水平逐渐降低(均P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠氧化应激指标比较

2.5 各组大鼠炎症指标比较 与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平逐渐上升(均P<0.05),见表5。

表5 各组大鼠炎症指标比较(ng/L)

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是指心肌经历缺血后恢复血流供应而造成心肌损伤加重的病理现象,其原因在于再灌注会产生大量氧自由基进而损害心肌组织,该现象是影响心脏疾病患者预后的重要原因[6-7]。研究发现,合理的药物干预对于再灌注损伤的恢复具有积极作用,右美托咪定具有良好的镇痛作用,对血流动力学影响小,可通过抑制炎症反应、细胞凋亡等机制缓解心肌缺血再灌注损伤,但其作用机制尚不完全清楚[8-9]。

心肌缺血再灌注损伤的最终表现为心肌梗死面积增大,直观反映了心脏损伤的严重程度;CK-MB、LDH是临床常用的心肌损伤预警标志物,二者通常存在于细胞质中,当心肌组织因缺血缺氧受损时,心肌细胞膜被破坏,CK-MB、LDH由心肌细胞渗入到血液中,致使血清中浓度显著升高[10-11]。本研究结果显示,与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组血清CK-MB、LDH水平依次升高,且右美托咪定预处理组心肌梗死面积百分比明显小于心肌缺血再灌注组,说明右美托咪定预处理能显著减少心肌缺血再灌注大鼠心脏损伤,并缩小心肌梗死面积,与刘琨等[12]研究结果一致。

再灌注阶段自噬表达过度增强不利于细胞存活[13-14]。LC3、Beclin、P62蛋白是细胞自噬的重要组成部分,可有效检测心肌细胞自噬程度。机体对自噬过程的调控较为复杂,有多种信号通路参与其中,以PI3K/Akt/mTOR信号通路是最为突出。PI3K/Akt信号通路激活后导致Akt活化产生相应的生理效应,mTOR是PI3K/Akt信号通路下游最关键的自噬负调控因子,活化的Akt通过磷酸化作用激活mTOR信号通路,从而对自噬产生抑制作用;心肌缺血再灌注会导致氧化应激和炎症反应,进而抑制mTOR蛋白表达及其磷酸化,使得mTOR对心肌细胞自噬的抑制作用减弱[15-16]。本研究结果显示,与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组心肌组织中LC3、Beclin、P62蛋白表达依次升高,PI3K/Akt/mTOR表达则逐渐降低,意味着右美托咪定预处理针对心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制可能与下调心肌细胞自噬蛋白表达,从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。分析其原因在于,右美托咪定预处理能够在一定程度上使PI3K/Akt/mTOR表达在心肌缺血再灌注过程中升高,从而抑制心肌细胞自噬的过度上调,减少对组织器官的损伤,产生心脏保护作用[17]。

在心肌缺血再灌注损伤的病理进程中,氧化应激和炎症级联反应占据着重要地位,在心肌缺血时,低氧状态会引起细胞器损伤,激活心肌细胞过度自噬[18]。当发生心肌缺血再灌注损伤时,会破坏SOD活性,减弱机体抗氧化能力,造成细胞膜等结构破坏和功能损害;心肌缺血再灌注损伤引起缺血区域周围心肌组织炎性浸润,同时大量释放炎症细胞因子,进一步加重心肌损伤[19-20]。本研究结果显示,与假手术组比较,右美托咪定预处理组、心肌缺血再灌注组血清MPO、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平依次升高,血清SOD水平则逐渐降低,意味着右美托咪定预处理可抑制心肌缺血再灌注大鼠炎症因子表达、减轻氧化应激反应,这是因为右美托咪定通过激活α2受体发挥对炎性反应、氧化应激的抑制作用。

综上所述,右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏功能具有保护作用,可抑制炎症因子表达、减轻氧化应激反应,其作用机制可能与下调心肌细胞自噬蛋白表达,从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。