龙胆泻肝汤治疗葡萄膜炎作用机制的研究进展

李严为，樊倩，欧阳东，孙莉，王虹霞

葡萄膜炎（uveitis，UV）是以眼部炎症为特征的疾病的集合[1]。UV的发病机制复杂，感染、自身免疫性疾病、机械损伤均可能引起UV，其更多被认为是免疫介导的，具有免疫系统相关性[2]。UV是导致视力丧失的主要原因之一，易并发其他眼科疾病，包括青光眼、黄斑水肿和白内障等[3]。其中，前葡萄膜炎（anterior uveitis，AU）是UV 中最常见的类型，约占患者总数的50%[4]。临床上针对UV 目前尚无特效药物，糖皮质激素（glucocorticosteroid，GCS）是治疗UV 的主要手段，GCS 确实能够有效控制UV 的眼部炎症，但在治疗过程中带来的诸多副作用与其本身的诸多禁忌证却有较大弊端。近年来的研究[5-6]表明，中西医结合治疗能明显提高UV 的疗效。UV 属中医学“瞳神紧小”“瞳神干缺”“视瞻昏渺”“云雾移睛”等病范畴，病因病机与肝、胆最为相关，而龙胆泻肝汤（LongdanXieganDecoction，LDXG）是清利肝胆湿热的名方。近年来，LDXG 及其加减方在UV 的临床研究中有着较高的使用率，基础研究也发现单纯应用LDXG 可明显缓解UV 动物或细胞模型的病理损伤，减轻炎症反应。为了能更好地指导临床应用，本文对LDXG 治疗UV 的药理机制进行综述，现报道如下。

1 LDXG的组方及方解

LDXG出自清代医家汪昂编写的《医方集解》[7]，是临床应用较广且具有代表性的方剂之一[8]，全方由龙胆草、黄芩、栀子、泽泻、木通、车前子、当归、生地黄、柴胡和生甘草共10 味中药组成[9]，以龙胆草为君药，其有清热燥湿、泻肝胆火之功；黄芩、栀子共助清泻肝火之力，栀子、泽泻、木通、车前子可清利下焦湿热，“使肝胆火从小便出”，泽泻、木通、车前子又同时有“清心、分清泌浊”之功，五者共为臣药；肝胆实火“易耗伤阴液”，生地黄、当归养血柔肝，以防苦寒伤肝[10]，其中生地黄凉血亦养阴，当归活血养血，使全方凉而不凝，二者共为佐药；柴胡疏理气机，以防全方一派苦寒之品郁闭肝经之调达，生甘草调和众药，二者共为使药。全方具有清泻肝胆实火、清利肝经湿热的功效，主要治疗肝胆实火上炎及肝经湿热下注所致的临床诸症[11]。

2 LDXG干预UV的药效学研究

2.1 增强机体及局部抗氧化能力

氧化应激在UV 的发病过程中发挥重要作用，氧化应激介导的光感受器细胞损伤是自身免疫性UV 的早期病理改变，调节或控制氧化应激有助于改善UV 的症状[12]。白蛋白是机体最重要的内源性抗氧化剂之一[13]，UV 的发病与白蛋白的下降具有关联性[14]。唐凯等[15]发现，实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）大鼠在免疫后第4、8、12天的房水白蛋白水平均低于对照组，而LDXG干预的EAU 大鼠白蛋白在第12 天恢复至正常水平，提示LDXG 能够有效提升房水白蛋白浓度，减轻纤维蛋白渗出，对血-房水屏障有一定保护作用，从而减少氧化应激损伤。

2.2 调节机体及眼部免疫

田庆梅等[16]发现，使用LDXG 治疗且已治愈的肝胆火炽型AU 患者外周血的干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）和白细胞介素-17（interleukin 17，IL-17）水平降低，白细胞介素-10（interleukin 10，IL-10）水平升高。向圣锦等[17]发现，在UV 的治疗中LDXG 能够抑制促炎因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF- α）、白细胞介素-23（interleukin 23，IL-23）、IFN-γ、IL-17 等的表达，而增加抗炎因子IL-10 的表达，提示LDXG 能在一定程度上维持促炎因子和抗炎因子的相对稳态平衡，进而调节UV 的眼部免疫炎症反应。球蛋白是由淋巴细胞产生的一种血清蛋白，具有重要的免疫调节作用，UV发病时机体属于免疫亢进状态，球蛋白水平升高。动物实验研究[15]显示，LDXG 能干预球蛋白水平使之趋于稳定状态，表明LDXG 能够降低机体对自身抗原的免疫应答。LDXG 还可升高T细胞CD4+比例、降低CD8+比例，提高细胞免疫和体液免疫的作用[18]。还有研究[18-19]发现，LDXG 可升高实验动物的血清溶菌酶、溶血素抗体水平和T细胞转化率，对免疫功能有明显促进作用。

2.3 镇痛和抗炎作用

LDXG 能够改善AU 患者眼部疼痛症状，但其作用机制尚不明确[20]。蒲维娅[21]发现，LDXG 可减少疼痛模型小鼠的扭体次数，延长痛阈值，具有显著的镇痛作用。此外，LDXG对多种炎症过程均有显著抑制作用，如肝胆湿热型分泌性中耳炎的炎性渗出、毛细血管通透性升高、炎性介质释放等[22]。

3 LDXG干预UV的分子生物学研究

3.1 Notch信号通路

3.1.1 CD4+T 淋巴细胞与Th17/Treg 细胞 LDXG 可调控CD4+T 淋巴细胞向辅助性T 细胞（T helper cell，Th）17 或调节性T 细胞（regulatory cell，Treg）分化，改善UV 病程中的Th17/Treg细胞比例失衡，从而有助于机体的免疫功能恢复。白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）与转化生长因子- β（transforming growth factor β，TGF-β）是决定CD4+T淋巴细胞向Th17 或Treg 细胞分化的关键细胞因子[23]，有研究[24]报道，Treg 细胞数量减少或功能紊乱、Th17/Treg 细胞失衡均可导致EAU 的发生。还有研究[25]证实，Th17/Treg 细胞比例失衡与EAU 病程发展密切相关。Notch 信号通路是维持机体免疫平衡的重要信号通路，其信号分子可调控CD4+T淋巴细胞向Th17/Treg 细胞分化。刘滨等[26]发现，EAU 大鼠造模12 d后Th17/Treg 细胞比例失衡，脾和淋巴结中的Notch1、Notch2和Notch4 表达异常增高。殷学伟等[27]发现，经LDXG 干预的EAU 大鼠的脾脏、淋巴结、眼组织中Notch1蛋白、δ样蛋白-4表达均低于对照组，而LDXG 可抑制Notch 通路活化，减轻Th17/Treg 细胞比例失衡，调节免疫状态和促进免疫修复，有效维持眼局部免疫平衡，从而对UV起到干预作用。

3.1.2 RBPJ基因与Th1/Th2细胞 Th1/Th2比例及相关细胞因子表达失衡与UV 的发生发展密切相关[28]。在UV 发生发展过程中，Th1、Th2 是一组起截然相反作用的细胞，前者对疾病起加速促进作用，后者则为抗炎表达[29]。Th1 细胞以分泌IFN-γ 为主要特征，主要负责细胞免疫、诱导迟发型超敏反应，而Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-13，其中IL-4 分泌最具有代表性，主要参与免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1，IgG1）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）抗体产生。IFN-γ 和IL-4 可以分别代表Th1 和Th2细胞应答的水平[30-31]。人重组无毛结合蛋白抑制因子（recombining binding protein suppressor of hairless，RBPJ）是一种转录因子，在细胞核内发挥重要作用，参与Notch 信号通路的调控[32]。在UV 的发展过程中，Notch信号通路的活化在Th1 和Th2 细胞分化过程中起重要作用，这和UV 的发病进程密切相关。周梦贤等[33]发现，使用LDXG 干预的EAU 大鼠机体及眼组织中RBPJ及蛋白表达水平均降低，Th1/Th2细胞比例逐渐恢复均衡，提示LDXG 可下调转录因子RBPJ 的表达来抑制Notch 信号通路的活化，降低Th1 细胞以及IFNγ 表达水平，提高Th2 细胞以及IL-4 表达水平，改善Th1/Th2细胞比例，达到治疗UV的目的。

3.2 M1/M2巨噬细胞

巨噬细胞是一种重要的抗原提呈细胞，在IFN-γ、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等炎症因子刺激作用下，巨噬细胞可极化为促进疾病进展的M1 型巨噬细胞；而在Th2 细胞因子作用下，巨噬细胞可极化为促进组织修复的M2 型巨噬细胞[34]。M1 型巨噬细胞分泌多种促炎因子，如白细胞分化抗原86（cluster of differentiation 86，CD86）、TNF-α、一氧化氮合成酶（innovation neighborship originality and satisfaction，iNOS）等；M2 型巨噬细胞则分泌抗炎因子，如精氨酸酶1（arginase1，Arg1）及IL-10 等[35]，2 种标志物是竞争性酶的关系，共同调控巨噬细胞的整体功能。M1/M2型巨噬细胞极化失衡可影响自身免疫性疾病如UV 的发展[36-37]。殷学伟等[38]发现，相比对照组大鼠，EAU 大鼠机体与眼组织内iNOS的表达升高，Arg1 表达降低，M1/M2 型巨噬细胞比例不均衡；而LDXG 干预组大鼠血清及眼组织中iNOS 表达降低，Arg1 表达升高，M1型极化比例下降，M2型极化比例升高，其比值逐渐均衡，提示LDXG 对UV 的治疗作用可能与其对M1/M2 型巨噬细胞极化的调控有关。

3.3 补体C4与MBL2表达

UV 的发病与眼部免疫功能失调、补体系统紊乱有关[39]。补体C4 可调节T 细胞的免疫应答作用，血清中补体C4 表达较高会加速UV 的发生发展，反之则有积极的抵御作用[40]。ZHANG L 等[41]发现，敲除C4 基因的EAU 小鼠视网膜炎症严重程度低于野生型小鼠。甘露糖结合凝集素（mannosebinding lectin，MBL）是聚集蛋白家族的成员之一，也是免疫系统的组成部分，其作为信息传递分子，参与调控细胞分化、增殖、凋亡等多种细胞生物学过程，如补体激活等[42]，低水平的MBL 与感染性或自身免疫性疾病具有相关性。有研究[43]发现，血清中MBL 表达较低的患者易形成治疗抵抗，且类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者低水平的MBL 又与放射性关节损伤相关，提示高血清含量的MBL 或许是免疫性疾病的保护因素。魏慧霞等[44]发现，LDXG 能降低血清补体C4 表达水平，提高血清MBL2 表达水平，调节全身补体系统，从而促进机体及眼组织免疫功能的修复，加速UV 眼部炎症的消退。

综上所述，目前研究发现的LDXG 治疗UV 的信号通路有以下3 条：（1）LDXG 通过抑制Notch 通路活性，改善UV 病程中的Th17/Treg细胞比例失衡；（2）LDXG可下调RBPJ转录因子，抑制Notch 通路活性，降低Th1细胞以及IFN-γ 表达水平，提高Th2 细胞以及IL-4 表达水平，改善Th1/Th2 细胞比例；（3）LDXG 可调控M1/M2 型巨噬细胞的极化，下调促炎因子iNOS，上调抗炎因子Arg1，使M1/M2 型巨噬细胞比例平衡（图1）。

图1 LDXG治疗UV的信号通路

4 小结

近年来，在我国临床医生和研究人员的努力下，中西医结合治疗UV 得到了广泛应用，中医药已然成为UV 治疗中重要的部分。在临床的实际工作中，医生更期望UV 患者的眼部症状加以控制，并降低其复发率和药物副作用[45]。随着眼免疫学与UV研究的不断发展，UV的研究热点也在发生变化，由原来的如何控制UV 发病逐步转向探究UV 的发病根源，以及患者预后生活质量。LDXG 具有清泻肝胆实火、清利肝经湿热的功效，临床被广泛应用于肝胆火炽型瞳神紧小。针对UV 主要病理变化，LDXG 或能通过多种途径治疗UV，其中以免疫调节作用最为显著。其不仅能够减轻UV 患者眼局部炎症，同时还可改善机体免疫功能，缩短病程，降低复发率。但UV 目前缺少一套完整的指南共识，临床医师进行辨证论治和遣方用药的方法不尽相同，不利于开展多中心、大规模的临床研究及推广。在此背景下，未来学者还需对LDXG 治疗UV 建立更加完善的研究体系，并挖掘探索出更多类似LDXG 的中药复方的潜力，推进中医药现代化发展。