养血补肾方对形觉剥夺性近视豚鼠巩膜重塑及TGF-β2的作用研究

罗悦，郭晓勤，陈亦霞，曹雯媗，亢泽峰，庄曾渊，杨剑英，吴宁玲

近视是屈光不正的一种形式，表现为视远模糊、屈光度超过-0.50 D、轴向长度增加等[1]。如今，近视正影响着全球约25 亿人的视觉质量[2]。研究[3]认为，巩膜重塑是高度近视的根本原因之一，而转化生长因子-β2（transforming growth factor-β，TGFβ2）是巩膜重塑的关键调节因子。本课题组前期研究[4]发现，运用养血补肾方（YangxueBushenFormula，YXBS）可以改善高度近视视网膜的血供，延缓高度近视发展。本研究以形觉剥夺性近视（form-deprived myopia，FDM）豚鼠模型为研究对象，观察YXBS 对FDM 豚鼠巩膜胶原及TGF-β2 表达的影响，初步探讨YXBS 治疗近视、影响巩膜重塑的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2 周龄雄性普通级健康三色豚鼠40 只，体质量180～200 g，购自北京科宇动物养殖中心[许可证号：SCXK（京）2022-0004]，饲养于中国中医科学院眼科医院眼功能实验室，自由进食，室温20～22 ℃，昼夜循环照明，定期检查豚鼠眼部健康状况。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 药品、试剂与仪器

1%复方托吡卡胺滴眼液、0.4%盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药有限公司，J20210051、H20210362），鼠抗TGF-β2抗体（上海惠诚生物科技有限公司，GMP-042），磷酸盐缓冲液（北京优尼康生物科技有限公司，SS1657）。眼科A/B型超声诊断仪（天津市索维电子科技有限公司，RU-1020CG），偏光显微镜（日本OLYMPUS 公司，BX51-P），带状检影镜（苏州六六视觉科技股份有限公司，YZ24），自动脱水机、铺片机、烤片机、切片机（德国Leica 公司，LEICA 300、LEICA 255、HI1220、RM2255）。

YXBS 的组成：枸杞子、菟丝子、五味子、覆盆子、车前子、熟地黄各15 g，白芍、当归、川芎、丹参、白术各12 g，黄芪20 g，均由中国中医科学院眼科医院中药房提供，加水煎煮并浓缩成浓度为1 g/mL 的药液使用。

1.3 建立FDM豚鼠模型

正常饲养7 d后，选取40只豚鼠以塑料眼罩（乳白色半透明气球）遮盖右眼，以右眼作为模型眼；左眼不做特殊处理，为自身对照眼，建立FDM 豚鼠模型[5]。遮盖右眼、正常饲养60 d 后，行双眼检影验光、眼轴测量，以造模前后双眼屈光度和眼轴差异有统计学意义，视为造模成功。

1.4 分组与给药

将上述造模成功的40 只FDM 模型豚鼠随机分为YXBS 组和模型组（model group，MG），每组各20 只。YXBS 组豚鼠给予12.70 g/kg YXBS 灌胃，MG组给予灌胃等体积0.9%氯化钠注射液，每日1 次，连续15 d。

1.5 屈光度与眼轴检查

（1）屈光度：于造模前1 d 和造模后第60 天，将豚鼠置于暗室，1%复方托吡卡胺滴眼液散瞳，带状检影镜检影验光，双眼各1 次。散光以半量等效球镜度计算屈光度。（2）眼轴：于造模前1 d 和造模后第60 天，在豚鼠双眼结膜囊内滴入0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，在室内自然光环境，调整A超增益矫正仪器，应用A/B 超检测豚鼠眼轴，双眼各1 次，每次连续测量3次，取平均值。

1.6 HE染色观察巩膜形态

灌胃结束后1 d 后取材。豚鼠麻醉处死后，采用75%乙醇对双眼眼睑及周围消毒，标记与角膜中央水平径线处垂直的鼻侧、颞侧角膜缘，沿记号剪开球结膜，摘除豚鼠眼球，置于视野操作台的玻璃皿中。于显微镜下用眼科显微剪剪开角巩膜缘，依次去除眼前节组织、玻璃体，保留巩膜组织，放入4%多聚甲醛中固定，24 h后进行石蜡包埋、切片，并行苏木精—伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE），于显微镜下观察巩膜组织形态。

1.7 免疫组织化学染色检测巩膜TGF-β2表达

将上述制备的切片经浸蜡、脱蜡、洗蜡、抗原修复、封闭后，加鼠抗TGF-β2 抗体（稀释比例1∶200）孵育过夜。次日洗片后，加入二抗孵育1 h，依次进行显色、复染、中性树胶封片后，在光学显微镜下观察，并采用“北航图像分析系统”测量阳性区灰度值，图片采集均从视神经切面旁开一个视野开始，在高倍镜视野下以400 倍拍摄2～3 个图像，阳性区灰度值越大，则TGF-β2表达水平越高。

1.8 统计学方法

使用SPSS 25.0统计分析，符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MG组FDM豚鼠屈光度与眼轴的变化

（1）屈光度：造模前MG 组豚鼠双眼屈光度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；造模前对照眼屈光度较造模后，差异无统计学意义（P＞0.05）；与造模前比较，造模后模型眼屈光度降低（t=15.960，P=0.000），且低于造模后对照眼（t=14.962，P=0.000），差异有统计学意义。（2）眼轴：造模前MG 组豚鼠双眼眼轴比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后双眼眼轴均较造模前延长（t模型眼=21.274，t对照眼=15.844，均P=0.000），且模型眼眼轴长于对照眼（t=5.998，P=0.000），差异均有统计学意义（表1）。

表1 FDM豚鼠屈光度与眼轴的变化（±s，n=20）

表1 FDM豚鼠屈光度与眼轴的变化（±s，n=20）

注：* 与对照眼比较，P＜0.05；# 与造模前比较，P＜0.05；FDM形觉剥夺性近视

眼别模型眼对照眼t值P值屈光度（D）造模前3.52±0.79 3.57±0.72 0.296 0.384造模后-2.88±1.61*#3.12±0.79 0.296 0.384眼轴（mm）造模前7.32±0.18 7.35±0.16 0.557 0.581造模后8.60±0.20*#8.23±0.19#5.998 0.000

2.2 YXBS对FDM豚鼠巩膜形态的影响

MG 组豚鼠对照眼巩膜胶原呈紧密排列状态，纤维间隙小，纤维束间均匀分布着胶原细胞，胶原细胞胞核数量较多，纤维分布有序，走行规则、结构较均一；MG 组豚鼠模型眼巩膜厚度明显缩小，纤维直径缩小，巩膜胶原稀疏，走行欠规则，纤维间隙扩大；YXBS 组模型眼巩膜胶原排列较为紧密，纤维束间均匀分布着胶原细胞，胶原细胞胞核数量较多，纤维走行稍欠规则，纤维间隙稍缩短（图1）。

图1 YXBS对FDM豚鼠巩膜形态的影响（HE染色，×400）

2.4 YXBS对FDM豚鼠巩膜TGF-β2表达的影响

TGF-β2 阳性染色主要集中在光感受器细胞层，在MG 组模型眼中明显减弱，在MG 组对照眼、YXBS组模型眼中染色较强（图2）。2组豚鼠对照眼的TGF-β2 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照眼比较，2 组豚鼠模型眼巩膜TGF-β2表达水平均降低（tYXBS=4.538，tMG=6.981，均P=0.000），且YXBS 组豚鼠模型眼TGF-β2 表达水平高于MG 组模型眼（t=2.154，P=0.049），差异均有统计学意义（表2）。

图2 YXBS对FDM豚鼠巩膜TGF-β2表达的影响（免疫组织化学染色，×400）

表2 YXBS对FDM豚鼠巩膜TGF-β2表达的影响（±s，n=8）

表2 YXBS对FDM豚鼠巩膜TGF-β2表达的影响（±s，n=8）

注：* 与对照眼比较，P＜0.05；# 与MG组比较，P＜0.05；FDM 形觉剥夺性近视；TGF-β2 转化生长因子-β2

组别YXBS组MG组t值P值TGF-β2模型眼109.04±12.12*#95.82±12.43*2.154 0.049对照眼132.20±7.84 133.24±8.68 0.252 0.805

3 讨论

研究[6]表明，眼球后极部巩膜异常扩展、变薄伴巩膜细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度降解是高度近视不断发展的关键病因之一。实验研究[7]显示，眼轴延长与巩膜重塑直接相关，而巩膜重塑取决于巩膜ECM 构成的改变。巩膜ECM 由巩膜成纤维细胞合成，胶原是其主要组成成分，巩膜胶原蛋白的积累与分解，直接影响巩膜的生物力学，引起眼轴变化[8]。本研究结果显示，FDM 豚鼠模型眼的平均屈光度、眼轴，在形觉剥夺60 d 后降低，提示单眼FDM豚鼠模型成功建立。

TGF-β2 被认为是巩膜重塑的关键调节因子之一，研究[9-10]发现，高度近视患者巩膜TGF-β2 的表达水平与眼轴长度具有相关性。TGF-β2 表达的显著下调，可使成纤维细胞的增生活性降低，ECM 合成分泌减少，纤维巩膜变薄，巩膜抵抗力降低，巩膜易于延伸，从而导致眼轴延长[11]。有研究[12]认为，TGF-β受Wnt/β-连环蛋白信号通路调控，介导巩膜重塑。在FDM豚鼠的眼睛中，Wnt/β-连环蛋白信号通路被激活[13]，TGF-β2 作为Wnt/β-连环蛋白信号通路的下游因子，可促进ECM 中I 型胶原蛋白的降解，使巩膜胶原蛋白的积累减少，引起巩膜重塑[7]；TGF-β2 还参与了信号的跨膜传递，由跨膜I 型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体转导，从而介导细胞与ECM 之间的内部和外部通讯[14]，调节巩膜重塑。因此，通过调节TGF-β2 调控巩膜重塑可能是治疗近视的有效途径。

本研究结果显示，MG 组模型眼巩膜TGF-β2的表达低于对照眼，YXBS组模型眼巩膜TGF-β2的表达高于MG 组模型眼。由此可见，FDM 模型的建立下调了豚鼠巩膜TGF-β2表达，而YXBS可上调巩膜TGF-β2的表达。

有研究[15]认为，肝肾亏虚、气血不足是近视进展的基本病机，并总结出庄曾渊教授的经验方—养血补肾方。本方根据肝肾亏虚、气血不足的基本病机，由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子、熟地黄、当归、白芍、川芎、丹参、黄芪、白术组成，临床疗效良好。方中枸杞子补肝肾、益精明目，菟丝子补益肝肾明目，覆盆子益肾、养肝明目，车前子明目，五味子补肾益气生津，此五药重在补益肝肾明目；熟地黄补血滋阴，当归补血活血，白芍养血柔肝，川芎活血行气，丹参活血祛瘀，此四药重在养血活血；黄芪补气升气，白术健脾益气。诸药合用，共奏补肾明目、益气活血之功。

现代药理学研究[16]表明，YXBS中多种中药与近视巩膜重塑有关。黄芪的主要成分黄芪多糖在肿瘤、糖尿病等多种疾病中促进了成纤维细胞的增殖及I型胶原的合成。在近视动物模型中，有研究[17]发现黄芪、当归、丹参、五味子等中药组成的含药血清，能影响巩膜成纤维细胞的增殖，从而参与巩膜ECM 的合成与降解。此外，由枸杞子、菟丝子、五味子、车前子、丹参等组成的补精益视片，可上调近视眼中透明质酸的表达并下调转录因子激活蛋白c-jun的表达，参与巩膜重塑，达到干预近视的效果[18]。还有研究[19]证实，在高度近视人眼巩膜中，胶原纤维束明显变细，单个胶原原纤维的直径减小，这与本课题组前期研究结果一致，而YXBS 能有效延缓后巩膜延伸，阻止近视进展[20]。结合本研究结果，推测YXBS 可能通过Wnt/β-连环蛋白信号通路，上调FDM 豚鼠巩膜组织TGF-β2 的表达，使成纤维细胞的增生活性升高，影响巩膜ECM 胶原蛋白的合成及降解，调节巩膜重塑，进而抑制纤维巩膜变薄，提高巩膜抵抗力，有效抑制近视进展。

综上所述，本研究发现YXBS 可通过上调FDM豚鼠巩膜组织中TGF-β2 的表达，调节巩膜重塑，延缓巩膜变薄，控制近视发展。本研究可为临床养血补肾方的应用提供一定理论基础。