P2X3R对心肌梗死大鼠交感神经重构和室性心律失常的影响

毕莹莹 杨双 张舒红 唐艳红

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室,湖北 武汉 430060)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)会诱发各种室性心律失常如室性心动过速和心室颤动,这是导致MI高死亡率的重要原因[1]。研究[2-3]表明交感神经过度激活在MI后室性心律失常发生中起重要作用。因此抑制MI后交感神经过度激活能有效减少室性心律失常的发生。

嘌呤能配体门控离子通道3受体(purinergic ligand-gated ion channel 3 receptor,P2X3R)是嘌呤能受体家族中的一员[4],主要位于Aδ和C类神经纤维上,与配体ATP结合后,引起大量阳离子内流,改变神经细胞兴奋性。P2X3R激活与交感神经活动密切相关。之前的研究[5-6]表明,P2X3R拮抗剂可降低动脉血压、心率和肾交感神经活动。Xue等[7]发现下调颈动脉体P2X3R可通过调节交感神经活动降低高血压模型犬的血压。此外,心肌缺血时,颈上神经节P2X3R的上调与交感神经兴奋性反射的激活有关[5]。但P2X3R是否通过影响交感神经活动在MI后室性心律失常的发生中发挥作用有待进一步研究。因此,本研究旨在探究P2X3R拮抗剂A317491在MI后室性心律失常发生中的作用及可能的机制。

1 方法与材料

1.1 实验动物和分组

本研究选用40只成年雄性SD大鼠(体重180～220 g),均在保证充足饲料、水和室温( 24 ℃±2 ℃)的条件下饲养。适应性喂养1周后,将SD大鼠随机分成3组:(1)假手术(Sham)组(n=12);(2)MI组(n=14);(3)MI+A317491(MI+A)组(n=14)。通过结扎左前降支构建MI模型,心电图ST段抬高和病理性Q波出现表示建模成功。MI+A组腹腔注射A317491[0.5 mg/(kg·d)],Sham组和MI组大鼠分别腹腔注射等量的生理盐水,共7 d。

1.2 血压测量和心脏超声

MI后第7天,采用无创动物血压测量系统测量尾动脉血压。每只大鼠平均测量3次收缩压(systolic blood pressure,SBP)和舒张压(diastolic blood pressure,DBP),均由同一操作人员在同一环境下进行测量。血压测量结束后腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠,使用经胸超声心动图于仰卧位测量各组大鼠与心脏功能和结构相关的指标,如左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)等。

1.3 心电图和心率变异性

MI后第7天,采用PowerLab系统记录麻醉状态下大鼠Ⅱ导联心电图,记录时长为10 min,并用LabChart 8.0软件进行分析。选取250～300个周期计算心率变异性(heart rate variability,HRV)[8-9],HRV参数包括全部RR间期的标准差(standard deviation of normal RR intervals,SDNN)和相邻RR间期之差的均方根值(the square root of the mean squared differences of successive RR intervals,RMSSD)。此外,还分析了可以反映自主神经活动的平均心率(heart rate,HR)和所有RR间期的平均值(the mean value of all normal RR intervals,mean RR)。

1.4 程序化电生理刺激

MI后第7天,于麻醉状态下打开胸腔,进行程序化电生理刺激。动作电位时程(action potential duration,APD):采用S1S1刺激程序记录APD,在起搏周长(paced cycle length,PCL)为100 ms情况下连续刺激10次。然后使用Labchart 8.0计算90%的APD复极化时间(APD90)。有效不应期(effective refractory period,ERP):采用S1S2刺激程序记录ERP,在PCL=100 ms的情况下连续进行8次S1刺激,然后提前给予S2刺激。S1S2间期从100 ms开始,以10 ms幅度依次递减,当S2不能下传夺获心室时,从上一个间期以2 ms幅度递减至S2不能下传夺获心室时,S1S2间期即为心室ERP。室性心律失常诱发率:用频率50 Hz、持续时间2 s、重复10次的Burst电刺激脉冲诱发室性心律失常,室性心律失常定义为连续2 s及以上的不规则电活动,室性心律失常诱发率=各组诱发室性心律失常大鼠数/各组大鼠总数。

1.5 酶联免疫吸附测定

通过下腔静脉采血,静置1 h后以3 500 r/min的速度离心后吸取血清置于-80 ℃冰箱保存,同时收集左心室心脏组织。使用大鼠去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)酶联免疫吸附测定检测试剂盒(ELK biotechnology,ELK8956)检测血清和梗死周边组织NE浓度,检测步骤依据生产厂家说明书进行,NE检测浓度范围为78.13～5 000 pg/mL。

1.6 天狼星红染色和免疫荧光染色

收集的心脏组织用4%多聚甲醛固定24 h,将固定的心脏组织用石蜡包埋,切片厚度为3 μm。天狼星红染色:病理切片进行天狼星红染色,使用光学显微镜采集图像后用Image J软件进行分析。免疫荧光染色:心脏病理切片分别用P2X3R抗体(1：150,Immunoway), 酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体(1：300,Servicebio)和生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)抗体(1：200,Novus)在4 ℃冰箱孵育过夜,用荧光素耦联的二抗(CoraLite488/CY3)在室温下避光孵育40 min,经PBS清洗3次后使用DAPI(1：1,Sigma)孵育,然后进行干燥和封片。用荧光显微镜拍摄图像,并用Image J软件进行分析。

1.7 蛋白质印迹法

蛋白质印迹法(Western blot)提取心脏总蛋白,BCA试剂盒进行定量。定量蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并电转至PVDF膜上,室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h,洗膜,4 ℃下将膜分别置于P2X3R(1：1 000,Servicebio)、TH(1：1 000,Servicebio)、GAP-43(1：500,Servicebio)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(1：10 000,Abcam)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)(1：10 000,Abcam)、纤维连接蛋白(1：500,Abcam)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：10 000,Abcam)一抗工作液孵育过夜。洗膜后,室温下将膜与对应二抗(1：2 000)孵育1 h,洗膜,滴加ECL试剂显影,通过Image J软件对蛋白灰度值进行分析。

1.8 统计分析

采用GraphPad Prism 8.01软件分析和处理数据。连续变量以均值±标准差表示,组间比较采用方差分析(ANOVA)。各组室性心律失常诱发率以百分比表示,并使用Fisher精确检验进行分析。P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 A317491对MI后心功能、血压和P2X3R表达的影响

如表1所示,MI导致LVEF和LVFS降低,LVEDD和LVESD增加,A317491可以改善MI大鼠的上述变化(P<0.05)。间接血压测量结果显示3组血压间无统计学差异(表1)。MI组P2X3R的表达较Sham组明显上调。而与MI组相比,MI+A组P2X3R表达减少 (P<0.05)(图1A～D)。

表1 3组大鼠超声心动图参数和血压比较

注:A图为MI 7 d后梗死周边区P2X3R的免疫荧光染色,B图为Western blot数据显示梗死周边区P2X3R蛋白的表达,C和D图为P2X3R的免疫荧光定量分析和蛋白表达比。所有数值均以均值±标准差表示,每组n=6,∗∗表示P<0.01,∗表示P<0.05。

2.2 A317491对MI后HRV和NE含量的影响

与Sham组相比,MI组大鼠HR显著升高,其他HRV变量,包括mean RR、SDNN和RMSSD均显著降低。经A317491处理后,上述指标均有所改善(P<0.05)(图2 A～D)。此外,MI组大鼠血清和梗死周边区NE浓度明显高于Sham组大鼠,但与MI组相比,MI+A组明显降低(P<0.01)(图2 E～F)。

注:A～D图为HR、mean RR、SDNN、RMSSD的HRV参数,每组n=12;E和F图为梗死周边区及血清NE浓度,每组n=6。所有数值均以均值±标准差表示,∗∗表示P<0.01,∗表示P<0.05。

2.3 A317491改善梗死周边区交感神经重构

与Sham组相比,MI组大鼠TH阳性神经纤维显著增加,而MI+A组大鼠TH阳性神经纤维减少。与TH结果相似,MI+A组大鼠GAP-43阳性神经纤维密度较MI组大鼠明显减小(P<0.05)(图3A、C、D)。与Sham组相比,MI组梗死周边区TH和GAP-43蛋白表达明显增加。使用A317491后,TH和GAP-43蛋白表达减少(P<0.05) (图3B、E、F)。

2.4 A317491减轻梗死周边区结构重构

天狼星红染色显示MI组大鼠梗死周边区出现大量胶原纤维,而MI+A组梗死周边区胶原纤维明显减少(图4 A)。Western blot条带显示,相较于Sham组,MI组大鼠α-SMA、纤维连接蛋白、TGF-β1表达升高,A317491处理使MI大鼠相应指标表达减少(P<0.01)(图4 B～E)。

2.5 A317491对梗死周边区心室电重构的影响

图5A和图5D为APD和Burst的典型刺激方案。图5B和图5C显示与Sham组大鼠相比,MI组大鼠APD90和ERP显著降低,而A317491给药后APD90和ERP显著延长(P<0.01)。Sham组室性心律失常诱发率为8.3%(1/12),MI组为75%(9/12),MI+A组为33%(4/12)(Sham组 vs MI组,P<0.01;MI 组vs MI+A组,P<0.05;图5E),且MI组室性心律失常持续时间较Sham组长,使用A317491后,室性心律失常持续时间明显缩短(P<0.05) (图5F)。

注:A图为PCL=100 ms时APD的代表性记录;B图为PCL=100 ms时的APD90,每组n=12;C图为ERP,每组n=12;D图为Burst诱发的代表性心室颤动发作;E图为室性心律失常诱发率,每组n=12;F图为室性心律失常持续时间。n≥3的数值均以均值±标准差表示,∗∗表示P< 0.01,∗表示P<0.05。

3 讨论和结论

MI可导致心力衰竭和心律失常等一系列并发症,严重威胁人类的健康。恶性室性心律失常是MI患者恢复期致死的主要原因之一。

MI会导致心肌细胞坏死、心室重塑以及电重构,在正常心肌和梗死周边区极易形成折返环,因此MI患者易发生室性心律失常[10-11]。交感神经过度激活和重构可导致心脏电传导紊乱,增加心电不稳定性,诱导MI后心律失常[12]。抑制交感神经可有效缓解MI诱发的心律失常[13]。心肌纤维化可改变电生理和心肌结构,包括离子通道异常(如钾离子通道和钙离子通道)、传导异质性和心室扩张[14-16]。Wang等[17]发现心脏去交感神经可以通过减少TGF-β受体信号通路的激活,改善MI大鼠左心室非梗死区域的心肌纤维化。本文主要研究P2X3R抑制剂A317491对MI后交感神经重构、心脏结构重构以及室性心律失常的影响。

在本研究中, MI组大鼠梗死周边区P2X3R的表达上调,而MI+A组大鼠P2X3R表达下调。这与前人在高血压、糖尿病和心肌缺血损伤模型大鼠中发现神经节或传入神经上P2X3R表达增加的研究一致[6,18-20]。此外,Wang等[21]发现心肌缺血损伤模型大鼠心脏P2X3R表达上调,A317491可降低P2X3R表达。本研究中,经超声检查各组心脏功能相关指标发现,MI组LVEF、LVFS、 LVEDD和LVESD指标均较Sham组明显恶化,说明MI大鼠的心脏功能受损,而MI+A组LVEF、LVFS、LVEDD和LVESD指标均较MI组有明显改善,提示A317491可明显改善MI大鼠的心脏功能。与此同时,A317491能显著降低MI大鼠梗死周边区纤维化水平,改善HRV,降低血清和梗死周边区NE浓度。新近研究[22]表明,P2X3R抑制剂AF-130可减少MI后心力衰竭大鼠外周化学感受器放电,恢复自主神经平衡,改善HRV,保护心脏功能,这与本文的研究结果一致。TH和GAP-43是心脏交感神经过度激活和重构的标志物[23],通过检测TH和GAP-43评估交感神经重构情况,发现MI大鼠TH和GAP-43阳性神经纤维密度和蛋白表达水平明显升高,而使用A317491处理组大鼠的相关蛋白则减少,提示A317491可以减轻MI大鼠心脏交感神经过度激活和交感神经重构。MI后心肌电生理特性发生改变,主要表现为缺血区心肌ERP和APD缩短,室性心律失常易感性增加[24]。本文通过程序性电刺激证实A317491可延长APD和ERP,降低室性心律失常诱发率,说明A317491具有室性心律失常保护作用。

综上所述,A317491可能通过抑制P2X3R改善MI后的交感神经重构和结构重构,进而降低MI后室性心律失常的易感性。