银杏叶提取物中复合成分的药理活性分析

2023-10-13程晶

化工设计通讯 2023年9期

程晶

（泉州医学高等专科学校，福建泉州 362000）

银杏科银杏属植物银杏的外种皮，种子即白果，树皮均可以入药，本次研究银杏叶，其主要活性成分包括：银杏叶黄酮类化合物、银杏叶萜内酯化合物、银杏叶聚戊烯醇内酯、银杏叶多糖类、银杏叶烷基芬酸类化合物、银杏叶有机酸类、银杏叶精油的化学成分及银杏叶其他营养成分。

银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract，GBE）具有抗氧化、改善微循环及脑保护等作用。已经有证据指出，GBE 对社会隔离小鼠行为学具有改善作用。

本课题挑选三周龄刚断奶的青年仔鼠作为实验动物而建立青少年期久坐乏运动的实验动物模型，通过优化提取溶剂获得较优的提取条件，并使用该条件下获得的提取物探讨银杏叶提取物对青少年期久坐乏运动大鼠行为学的影响，揭示相关调控的信号传导通路。该项目的成功实施有利于银杏叶提取物药用价值的开发，为银杏叶提取物在临床干预中的应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

银杏叶（野外采摘）；芦丁对照品（江苏永健医药科技有限公司）；乙醇（AR）、甲醇（AR）、丙酮（AR）（西陇化工有限公司）；SD 大鼠（维通利华动物实验责任有限公司）。

DHG-9140A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（Millipore 公司）；ME104E 型电子天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶提取物的制备

新鲜摘取的银杏叶，挑选无虫害，无化肥，无虫药喷洒过，清洗自然风干后于65℃烘干至重量恒定，粉碎后过60目筛。参考冯金霞等的方法，取10 g 干燥银杏叶，按银杏叶与溶剂的质量比为1∶8加入溶剂，回流提取3 h，真空干燥，温度控制在60℃后称重，测总黄酮含量。

1.2.2 提取溶剂的选择和优化

根据制备方法，通过单因素实验，选用不同浓度的三种溶剂，乙醇（10%~90%）、甲醇（10%~90%）及丙酮（10%~90%）进行提取，以提取物的提取率作为评价指标。提取率=（提取物质量/干燥银杏叶质量）×100%

采用L9（34）表进行正交试验，因素水平见表1，选取溶剂比例（A）、浸提次数（B）和浸提时间（C）作为考察因素进行正交优化试验，以提取物的总黄酮含量为评价指标，确定银杏叶提取物的提取优化工艺条件。参照黄晓冬等[18]的方法测定总黄酮含量，总黄酮含量以芦丁计。

表1 正交实验因素水平

2 结果与讨论

银杏叶提取物的制备：选择三种不同溶剂，乙醇（10%~90%）、甲醇（10%~90%）及丙酮（10%~90%）进行提取，以提取物的提取率作为评价指标。结果表明，以乙醇作为提取溶剂时，60%~80%的乙醇一次提取率趋于稳定，均在68%以上；以甲醇作为提取溶剂时，60%的甲醇一次提取率最高，约为60%；以丙酮作为提取溶剂时，60%的丙酮一次提取率最高，约为72%，但后续处理困难。因此选用60%~80%的乙醇作为提取溶剂。

采用正交试验，优化各因素不同水平下银杏叶提取物的最优制备方法，以总黄酮含量作为评判指标。正交设计与实验结果的直观分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

从表2、表3 可以看出，影响银杏叶提取物提取工艺的因素依次是溶剂比例、浸提次数、浸提时间。获得的最佳工艺组合为A2B3C2，即溶剂比例为70%，浸提次数为3次，浸提时间为3 h。由表3可知，各因素银杏叶提取物提取工艺均无显著性影响。在此条件下，重复3次试验，银杏叶提取物中总黄酮含量平均为57.04%，RSD 为0.75%。

3 讨论

随着现代社会的发展，越来越科技化、简单化、便捷化的生活形式使得人们体力活动缺乏甚至消失，结肠癌、2型糖尿病、肥胖综合征等的出现增加罹患心血管疾病的风险。Laufs 等[6]首先通过动物单一运动量实验证实能引起动物内皮功能受损，传统的诱发心血管疾病的风险因子有氧化应激、炎症反应等，而在乏运动干预的研究中，模拟人类的久坐，少运动的生活习性，对于没有基础疾病的人也能引起血管功能内皮障碍。本课题组前期研究发表的《银杏叶提取物对青春缺乏运动大鼠行为学的影响》中模拟大鼠单一运动，久坐不运动，中强度运动等模式，干扰大鼠的正常生活习性，发现缺乏运动组大鼠脑实质氧化应激程度呈现过氧化失衡状态，银杏叶提取物注射后SOD 活性上调，MDA 含量降低，逆转机体的氧化应激状态。此外，You 等[8]首次在上述实验中加入一定时间的独处行为模式，既减少动物的运动行为，又孤立个体。独处孤立无外交行为的生活方式所致的心理因素也可能引起动物机体免疫系统功能改变，通过丘脑-垂体-肾上腺素轴等调控机制引起一系列行为动作上的改变甚至机体病理生理改变，这方面应该予以重视。

林麒等[11]进行皮肤感觉、肌力、腱反射、增加正中神经、腓总神经运动传导速度和感觉传导速度的相关实验研究，观察各种数据指标，联合用药。通过两者之间的协同作用治疗糖尿病神经病变，联合用药可以改善周围神经组织的微循环，促进神经组织修复。陈红辉等[13]利用水迷宫及避暗试验，研究发现银杏叶提取物给药一段时间后能有效改善老龄痴呆大鼠模型在水迷宫中的学习记忆障碍，增加大脑海马区乙酰胆碱的含量。动物行为学已经是一门应用于各个领域的判断动物行为改变、恢复并辅助治疗疾病矫正训练的工具学科。有研究报道指出，银杏叶提取物配合康复锻炼能有效改善轻度认知障碍患者的认知功能及生活自理能力。银杏叶提取物对社会隔离小鼠行为学亦具有改善作用。

20世纪60年代，德国和法国科学家从一株中国古老银杏树里提取出银杏黄酮和银杏内酯后验证其具有抗心脑血管疾病功效，于是国际医药市场上即时地出现了以银杏叶提取物为主要制剂的药品，其中以“梯保宁”和“金纳多”为代表被广泛运用于国际市场。临床上用银杏叶提取物辅助治疗糖尿病、心脑血管疾病、血管性痴，其主要原因是它能明显地抗氧化保护脑组织改善微循环。由于银杏叶提取物注射给药青少年缺乏运动模型后出现的行为学改变鲜少有报道。因此实验研究通过新鲜银杏叶的制备，在提取工艺不同、时间不同、溶剂不同的情况下挑选制备最佳黄酮含量的方法，并将得到的制备物作用于青少年期久坐缺乏运动实验动物模型中，模型是将24只4周龄SD 雄鼠完全随机分为正常群居饲养组（GH）、乏运动独笼饲养组（AS）、银杏叶提取物独笼干预组（GBE），干预性饲养至8周龄，探讨银杏叶提取物对青少年期久坐缺乏运动大鼠行为学的影响，同时通过多个行为学的检测的指标：矿场试验、新物体识别试验、入侵试验、强迫游泳试验，分析该黄酮含量对其行为学的改变。分析得出：旷场试验中，AS 组大鼠安静时间减少，在旷场中央区域停留时间和次数减少。新物体识别试验中，AS 远离新物体，不碰触不探究情况居多。入侵实验中AS 组的攻击性明显高于其他两组。强迫游泳实验中，同样的时间内，AS 组游泳的圈数更多，应激反应更强烈。8周GBE 干预后，AS 组的昼夜活动情况、安静时间得到逆转，焦虑情绪缓解。初步揭示本实验制备的银杏叶提取物改善久坐缺乏运动大鼠行为学机制。