基于NRG-1/ErbB信号通路探讨黄芪多糖对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响

黄莉芳,刘超权

心血管疾病是全球死亡的首要病因,随着我国经济的迅速发展、人口老龄化等进程的加快,心血管疾病发病率持续增长,目前,患病总数已达2.9亿例,其中1 100万例为冠心病病人,已成为严重的公共卫生问题[1]。溶栓、冠状动脉旁路移植术、经皮冠状动脉介入术(PCI)等血运重建医学技术的应用与发展,可有效解决缺血心肌的血液灌注问题,减轻缺血相关损伤,但血液供应重新恢复也可能导致心肌损伤的加重,引发心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[2-3]。MIRI是难以避免的病理损伤,严重影响治疗效果,是临床治疗中亟待解决的难点。目前,临床针对MIRI采用的治疗策略主要包括缺血或药物预适应、抗氧自由基、抑制细胞内钙超载、微血管内皮细胞保护药物等[4]。中药以作用靶点多、起效环节众、副作用小等特点在MIRI的防治中彰显优势,也是目前研究的热点。黄芪多糖为中药黄芪的活性成分之一,研究显示,其对于MIRI大鼠损伤的心肌具有一定的逆转作用,但具体作用机制尚未明确[5]。本研究基于神经调节因子-1(NRG-1)/表皮生长因子受体(ErbB)信号通路探讨黄芪多糖对MIRI大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠70只,体质量220～260(243.62±12.83)g,购自中国医学科学院医学生物学研究所,动物许可证号:SCXK(滇)K2019-0002。所有大鼠于动物实验室内适应性饲养1周后开始实验。

1.2 主要药品、试剂与仪器设备

注射用黄芪多糖,规格:每瓶250 mg,批准文号:国药准字Z20040086,生产批号:20200417,天津赛诺制药有限公司生产,采用生理盐水稀释,浓度为20、40mg/mL,现用现配。NRG-1重组蛋白,规格:每瓶10 μg,纯度>95%～98%,货号:ICA866Hu01,购自上海联迈生物工程有限公司。磷酸缓冲盐溶液(PBS)(武汉益普生物科技有限公司);RIPA裂解液、含吐温-20的Tris缓冲盐水(TBST)(定州百克赛斯生物科技有限公司);大鼠天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌钙蛋白T(cTnT)酶联免疫分析法(ELISA)试剂盒(上海莼试生物技术有限公司);原位细胞凋亡(TUNEL)检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、免疫组化试剂盒(武汉极捷生物技有限公司);硝酸纤维(NC)膜(博奥派克生物);考马斯亮蓝法蛋白水平测试盒、一步法凝胶制备试剂盒(北京雷根生物技术有限公司);兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、NRG-1、磷酸化表皮生长因子受体2(p-ErbB2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)抗体、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(武汉菲恩生物科技有限公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(青木生物技术有限公司);超敏ECL化学发光底物(北京四正柏生物科技有限公司)。TG16-WS型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),XSP-63X型荧光显微镜(上海光学仪器厂),BIOBASE2000型全自动酶免分析系统(意大利DAS公司),SE600型电泳仪、TE77XP型半干转膜仪系统(美国Hoefer公司),Image QuantLAS4000型化学发光成像分析仪(美国GE公司)。

1.3 造模及给药方法

参考文献[6]方法将大鼠随机分为对照组、模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组,每组14只。对照组进行假手术,其余各组采用左前降支结扎建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。所有大鼠禁食不禁水12 h,按350 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉完全后仰卧固定,连接呼吸机、心电图机,沿胸骨正中线纵向打开胸腔,暴露心脏,确定左前降支走向,将6-0缝合线从左心耳根部下缘2 mm处进入到肺动脉圆锥边缘穿出;模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组将细小乳胶管垫在缝合线上并结扎左前降支,此时心电图ST段应抬高,心脏颜色逐渐青紫或苍白,30 min后将结扎线打开,再灌注120 min,此时心电图ST段应逐渐下降>50%;对照组仅作套环而不结扎左前降支。

造模前30 d,模型组、对照组和阳性对照组大鼠分别按1 mL/kg尾静脉注射生理盐水,术后每日1次注射;黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组分别按1 mL/kg尾静脉注射20、40 mg/mL黄芪多糖溶液,术后每日1次注射。造模前30min,阳性对照组给予4 μg/kg NRG-1溶液尾静脉注射,术后每日1次注射。各组均连续干预30 d。

1.4 标本采集与处理[7]

造模后,采集腹主动脉血5 mL,不抗凝,待凝固后3 000 r/min离心20 min收集上血清,冻存于-80 ℃环境。处死大鼠取心脏,4 ℃生理盐水洗净,切取左前降支结扎处以下的左心室、心尖组织,其中1/2经10%中性甲醛固定后制成厚度为4 μm的石蜡切片用于TUNEL染色、免疫组化染色;剩余心肌组织冻存于液氮内用于蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测。

1.5 ELISA法检测大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平

取出冻存血清,使其恢复为室温,按照ELISA试剂盒说明书中的步骤测定血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平。

1.6 TUNEL染色法观测大鼠心肌组织细胞凋亡情况[8]

取心肌组织石蜡切片,65 ℃烤1 h,置于二甲苯中10 min×3次去除石蜡,之后分别置于100%、95%、80%乙醇中复水,取出后自来水冲洗,然后置于20 μg/mL蛋白酶K溶液中反应20 min(37 ℃),PBS洗涤5 min×3次,置于渗透液内8 min再次用PBS洗涤,采用试剂盒配制TUNEL反应液,取50 μL滴于切片上,湿盒避光反应1 h(37 ℃),PBS洗涤后用3%过氧化氢孵育30 min,再次PBS洗涤,滴加转化剂-过氧化物酶(POD),湿盒避光反应20 min(37 ℃),经DAB显色、苏木素复染后,常规封片。在荧光显微镜下观察染色结果并拍照,记录凋亡阳性细胞(绿色荧光)数及总细胞数,细胞凋亡指数=凋亡阳性细胞/总细胞数×100%。

1.7 免疫组化染色法检测大鼠心肌组织Caspase-3表达水平[8]

取心肌组织石蜡切片,脱蜡、复水同TUNEL染色,置于柠檬酸盐缓冲液内高压高热修复抗原,PBS洗涤后,采用3%过氧化氢孵育30 min去除内源性过氧化氢酶,PBS洗涤后置于5%牛血清蛋白溶液内封闭1.5 h,PBS洗涤后置于Caspase-3一抗工作液内反应2 h(室温),再经PBS洗涤后置于二抗工作液内反应1 h,最后经DAB显色、苏木素复染后,常规封片。在光学显微镜下观察染色结果并拍照,计数阳性细胞核(棕黄色染色)数及总细胞核数,计算Caspase-3阳性表达率。

1.8 Western Blot法测定大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表达水平[9]

取冻存心肌组织剪碎,滴加裂解液RIPA匀浆,置于冰上30 min裂解,转移至离心管内,12 000 r/min离心5 min(4 ℃),取上清液,用考马斯亮蓝法进行蛋白定量,-80 ℃保存备检;将制好的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶灌注在电泳玻璃板之间并固定;取蛋白样本30 μg,与上样缓冲液混匀,煮沸10 min,冷却后取上样;电泳条件为:浓缩胶80 V、30 min,分离胶120 V至溴酚蓝跑出;分离获得的蛋白条带通过300 mA恒流电转至NC膜上,适当剪裁;NC膜置于封闭液内1 h,然后分别置于含有NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax(1∶1 000稀释)及内参β-actin(1∶2 000稀释)一抗工作液中,于4 ℃密封反应16 h;第2天,TBST洗膜5 min×5次,然后置于1∶3 000稀释的HRP标记的二抗内,室温密封反应1 h,取出后TBST洗膜5 min×5次;置于用ECL化学发光底物内显色。采用化学发光仪显影同时采集图像,用Quantity One软件测定各条带灰度值,计算NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax灰度值与β-actin的比值。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平比较

与对照组比较,模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平均降低,且黄芪多糖低浓度组大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平高于黄芪多糖高浓度组和阳性对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平比较(±s)

2.2 各组大鼠心肌组织细胞凋亡指数比较

TUNEL染色结果显示,与对照组比较,模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织细胞凋亡指数均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织细胞凋亡指数均降低,且黄芪多糖低浓度组大鼠心肌组织细胞凋亡指数高于黄芪多糖高浓度组和阳性对照组(P<0.05)。详见表2、图1。

图1 各组大鼠心肌组织细胞凋亡TUNEL染色结果(×400)(A为对照组;B为模型组;C为黄芪多糖低浓度组;D为黄芪多糖高浓度组;E为阳性对照组)

表2 各组大鼠心肌组织细胞凋亡指数比较(±s) 单位:%

2.3 各组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率比较

免疫组化染色结果显示,与对照组比较,模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率明显升高(P<0.05)。与模型组比较,黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率明显降低,且黄芪多糖低浓度组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率高于黄芪多糖高浓度组和阳性对照组(P<0.05)。详见表3、图2。

图2 各组大鼠心肌组织Caspase-3表达检测结果(免疫组化染色,×200)

表3 各组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率比较(±s)

2.4 各组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

与对照组比较,模型组、黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表达水平明显降低,Bax表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表达水平明显升高,Bax表达水平明显降低,且黄芪多糖低浓度组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表达水平低于黄芪多糖高浓度组和阳性对照组,Bax表达水平高于黄芪多糖高浓度组和阳性对照组(P<0.05)。详见表4、图3。

图3 各组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表达条带图(A为对照组;B为模型组;C为黄芪多糖低浓度组;D为黄芪多糖高浓度组;E为阳性对照组)

表4 各组大鼠心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

MIRI多继发于缺血性心脏病缺血区血流灌注恢复后,是一个复杂的病理生理变化过程,可表现为血液无复流、心律失常、心肌顿抑、微循环障碍等,不仅影响治疗效果,还会加重病人病情[10]。MIRI的发病机制主要涉及过量氧自由基的产生、心肌细胞内钙离子蓄积超载、能量代谢障碍、细胞凋亡以及炎症反应等,这些病理机制既相互关联又相互作用,通常作为切入点来探讨心肌防护的新策略[11]。研究显示,NRG-1/ErbB信号通路具有心肌保护作用,其抗炎、抗凋亡、抗氧化等多方面作用与MIRI的发病机制相对应,有望成为MIRI治疗的新靶点[12]。

MIRI在中医学可归于“胸痹”“真心痛”“心痛”等范畴,属于本虚标实之证,且尤以气虚为主,气虚无力推动,津血运行不畅,久致瘀血、痰饮,妨碍气机,不通则痛,发为本病,故在治疗上应注重补气。黄芪为补气要药,有补中益气、升阳固本之效,是临床治疗MIRI的常用中药之一[13]。黄芪多糖是提取自黄芪的多糖类成分,具有多种药理作用,在MIRI的治疗方面,研究显示,黄芪多糖可通过多个途径发挥其保护作用,如部分抑制p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路,阻断其介导的炎症反应,减轻相关心肌损伤[14];抑制钙释放,缓解细胞钙超载情况,保护线粒体呼吸功能,同时抑制氧自由基过量产生以及线粒体膜电位、膜通透性转换孔异常开放,保护线粒体结构,纠正心肌能量代谢紊乱[15-17];激活NRG-1/ErbB及其下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路,从而抑制心肌细胞凋亡,防治糖尿病心肌病[18]。

本研究采用左前降支结扎再复通的方法成功建立了MIRI大鼠模型,使得模型组大鼠血清心肌酶水平较对照组明显升高,心肌细胞凋亡指数也明显增加,证实了MIRI存在心肌受损;而在造模前已经接受相应药物干预的黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组,血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平及心肌细胞凋亡指数均低于模型组,并且黄芪多糖干预组呈现一定量效关系,表明黄芪多糖可有效减轻MIRI引起的心肌细胞损伤,抑制心肌细胞凋亡,减轻MIRI病情程度,治疗效果与黄芪多糖浓度有一定关系[19-22]。

NRG-1为跨膜蛋白,属于表皮生长因子家族的一员,在心脏中一般由微血管内皮细胞合成分泌,具有调节心肌细胞发育和成熟,保护维持心肌细胞的功能[23]。ErbB为NRG-1的酪氨酸激酶受体,其中,ErbB2、ErbB4主要表达于成年心脏,NRG-1的心肌保护作用主要通过激活ErbB传递信号而实现,NRG-1/ErbB与MIRI密切相关,下游的两条重要信号通路为细胞外信号调节激酶通路以及PI3K/AKT[24]。研究显示,NRG-1可以通过激活PI3K/AKT来调节线粒体凋亡途径Bcl-2、Bax表达,进而抑制心肌细胞凋亡[25-28]。Bcl-2属于抗凋亡蛋白,对各种原因诱发的细胞凋亡均有抑制作用;Bax则与之作用相反,Bcl-2减少或Bax增加可开放线粒体通透性转换孔,促进前凋亡因子合成释放,激活终末剪切酶Caspase-3,启动细胞凋亡[29]。研究显示,抑制线粒体细胞凋亡是NRG-1/ErbB抗MIRI的一种途径[30]。本研究结果显示,与模型组比较,黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖高浓度组及阳性对照组大鼠心肌组织Caspase-3阳性表达率降低,心肌组织NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表达水平升高,Bax表达水平降低,表明黄芪多糖可激活NRG-1/ErbB信号通路,上调心肌组织Bcl-2表达,下调Bax及Caspase-3表达,对线粒体凋亡途径发挥抑制作用,这可能是黄芪多糖保护MIRI心肌的机制之一。

综上所述,黄芪多糖可减轻心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌损伤,抑制心肌细胞凋亡,其作用可能与激活NRG-1/ErbB信号通路,调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达有关。