细胞周期蛋白B2 基因在胰腺癌中表达的生物信息学分析

邹晶晶 郭敬强

胰腺癌发病率和死亡率逐年升高[1]。胰腺癌早期无特异性临床症状，诊断存在一定困难。胰腺癌恶性程度高，进展快，预后差[2]。寻找早期筛查的生物标志物和提高早期诊断率能够改善胰腺癌预后[3-4]。目前胰腺癌发生、发展的具体机制尚未阐明，临床上缺乏特异性的诊断和治疗靶标。筛查特异性、敏感的胰腺癌生物标志物是近年来的研究热点。细胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）是B 型细胞周期蛋白家族成员，位于高尔基体，是细胞周期调控机制的重要组成部分。已有研究发现CCNB2 在肺癌[5]、结直肠癌[6]、脑胶质瘤[7]等多种恶性肿瘤发生、发展中发挥重要作用。目前关于CCNB2 在胰腺癌中功能、预后评估的报道甚少。本研究基于生物信息学技术，探讨CCNB2 基因表达与胰腺癌关系，为胰腺癌的早期诊疗、病情监测及预后监测提供一定理论基础。

1 材料和方法

1.1 GEPIA 使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）平台，基于癌症基因组图谱（The Camcer Genome Atlas，TCGA）数据库和GTEx 数据。“Expression DIY”模块分析CCNB2 基因在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达，|log2FC| Cut-off 值设置为1，Cut-off 值设置为0.01。“Box Plot”模块分析临床分期与CCNB2 基因表达的关系，发现CCNB2 基因表达与胰腺癌分期呈负相关；“Survival Analysis”模块分析CCNB2 基因表达水平高低与生存指标关系。

1.2 Ualcan 使 用Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）平台，在“TCGA analysis”模块下的“TCGA gene analysis”界面，Scan by gene 输入“CCNB2”，TCGA dataset 输 入“Pancreatic adenocarcinoma”，选择“Explore”，分别选择“Expression”“Methylation”“Survival Analysis”，分析胰腺癌组织与正常胰腺组织中CCNB2 基因的表达和甲基化情况。

1.3 Timer 在Timer（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）平台，选择Timer 基因分析模块，在“Gene Symbol”输入“CCNB2”，在“Cancer Types”输入“PAAD”，分析CCNB2 基因与胰腺癌免疫细胞之间关系，并构建多因素Cox 比例风险模型。

1.4 cBbioPortal 在cBbioPortal（https://www.cbioportal.org/）平台进行胰腺癌CCNB2 基因突变分析。“Query”模块输入“PAAD”查询，选择所有数据库，“Query By Gene”输入“CCNB2”，点击“Submit Query”“Mutations”进行分析。共纳入1 034 例样本，来源2012 年Nature ICGC 数据99 例，2015 年Nat Commu UTSW 数据109例，2016 年Nature QCMG 数据456 例，Firehose Legacy TCGA 数据186 例，Pancancer Atlas TCGA 数据184 例。

1.5 STRING STRING（https:// string-db.org/）是在线可评估物种蛋白质相互关系的数据库。评估分数越高，蛋白存在相互作用的可信度越高。在STRING 界面，“Protein Name”输入“CCNB2”，“Organisms”选择物种“Homo sapiens”，CCNB2 相互作用蛋白。同时对CCNB2 基因进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行通路富集分析，推测CCNB2在胰腺癌中的相关功能和途径。

1.6 GeneMANIA GeneMANIA（http://genemania.org/）是交互式、可视化的在线蛋白质相互作用预测工具，对给定的基因查询列表进行分析，通过识别出功能相似的基因，来获得目标基因的相互作用蛋白[8]。本研究设置基因列表为CCNB2，构建蛋白质相互作用网络，以获得相互作用蛋白。

2 结果

2.1 CCNB2 基因表达结果 采用GEPIA 数据库和Ualcan 数据库分析CCNB2 基因在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达，结果显示胰腺癌组织中CCNB2 基因表达水平高于正常胰腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A、B（插页）。随着胰腺癌的进展，肿瘤临床分期偏迟，癌组织中CCNB2 基因表达水平下降（P＜0.05），见图1C（插页）。与正常胰腺组织比较，CCNB2 基因甲基化水平在胰腺癌组织中更高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1D（插页），说明胰腺癌具有高甲基化水平。

图1 胰腺癌肿瘤组织和正常胰腺组织中CCNB2 基因表达、甲基化水平和基因表达和临床分期之间关系[A：GEPIA 分析CCNB2在胰腺癌和正常组织表达，aP＜0.05；B：Ualcan 分析CCNB2 在胰腺癌和正常组织表达；C：CCCNB2 基因表达与临床分期的相关；D：CCNB2 基因在胰腺癌和正常组织甲基化水平]

2.2 CCNB2 基因在胰腺癌组织突变分析 6 项数据库中1 034 例样本共检出3 例突变，包括1 例重复突变多样本的患者，突变发生率为0.3%，见表1。

表1 胰腺癌组织中CCNB2 基因突变分析

2.3 胰腺癌组织CCNB2 基因表达与肿瘤免疫细胞结果分析 胰腺癌中CCNB2 基因表达与B 淋巴细胞、CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞及CD4+T细胞的免疫浸润均呈正相关（均P＜0.05）。Kaplan-Meier 生存曲线显示，高水平的CCNB2 患者生存率与低水平患者比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2（插页）。同时构建多因素Cox 比例风险模型见表2，胰腺癌预后的影响因素包括年龄和CCNB2 基因表达。

表2 胰腺癌多变量Cox 比例风险模型

图2 胰腺癌组织CCNB2 基因表达与肿瘤免疫细胞浸润结果（A：肿瘤免疫细胞浸润和CCNB2 基因表达相关性；B：胰腺癌组织CCNB2 基因高低表达患者的Kaplan-Meier 生存曲线，P＜0.01）

2.4 CCNB2 基因表达与胰腺癌患者临床预后关系高表达CCNB2 基因的胰腺癌患者的总生存时间、无病生存时间和生存率均偏低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3（插页）。

图3 CCNB2 基因表达与胰腺癌患者临床预后指标的分析结果（A：总生存时间；B：无病生存时间；C：生存率）

2.5 CCNB2 蛋白相互作用蛋白网络 通过GeneMANIA 网站预测CCNB2 的蛋白质相互作用网络，结果发现了包括CDK1、CDK2、CCNB1 等在内的20 个关键互作分子，见图4A（插页）。使用STRING 数据库构建与CCNB2 蛋白可能存在的相互作用蛋白网络图，见图4B（插页），发现与CCNB2 蛋白相关相互作用评分前10位蛋白，分别是CDC20（Score=0.999）、CDK1（Score=0.999）、CCNB1（Score=0.998）、CDK2（Score=0.998）、CKS2（Score=0.998）、PLK1（Score=0.997）、NCAPG（Score=0.996）、CKS1B（Score=0.996）、AURKA（Score=0.995）、BUB1（Score=0.995）。和GeneMANIA 数据库结果一致。同时通过富集分析可能的功能及参与的信号通路等，见表3、4。

表3 CCNB2 蛋白KEGG 通路富集分析

表4 CCNB2 蛋白GO 富集分析

图4 CCNB2 蛋白相互作用蛋白分析（A：GeneMANIA 数据库预测CCNB2 的蛋白质相互作用网络；B：STRING 数据预测CCNB2 的蛋白质相互作用网络）

3 讨论

胰腺癌预后较差，发现特异度强、灵敏度高的标志物，对改善其预后至关重要[9]。CCNB2 在多种癌组织中高表达，与肿瘤患者病情密切相关[10-12]。目前，CCNB2 在胰腺癌功能及机制方面的研究报道极少。本研究利用生物信息学技术分析CCNB2 在胰腺癌组织中表达情况，系统评估其在胰腺癌的发病及预后中的价值。

本研究结果显示，胰腺癌组织中CCNB2 表达高于正常胰腺组织。与CCNB2 低表达胰腺癌患者比较，CCNB2 高表达患者总生存时间、无病生存时间和生存率均偏低。Cox 比例风险模型分析发现，CCNB2 高表达的胰腺癌患者预后更差，表明CCNB2 高表达可能在胰腺癌的发病过程中起到作用。同时分析胰腺癌组织中CCNB2 启动子甲基化的水平和基因突变情况，显示胰腺癌组织中为高甲基化水平，基因突变率只有0.3%，表明CCNB2 基因的高甲基化可能是胰腺癌的一种潜在致病机制CCNB2 基因的突变可能不是胰腺癌发病的主要机制。可见CCNB2 可能是胰腺癌的一个独立预后因子。

胰腺癌的免疫治疗效果差强人意，可能与肿瘤微环境免疫抑制有关[13]。胰腺癌肿瘤微环境募集调节性T 淋巴细胞（regulatory cells，Tregs）或分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导CD4+T细胞转化成Tregs。Tregs 抑制效应性T 淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤作用，同时分泌颗粒酶、穿孔素促进CD8+T细胞凋亡，降低CD8+T 细胞对肿瘤细胞作用[13-14]。胰腺癌组织可见巨噬细胞，以M2 型巨噬细胞居多。在小鼠的肝细胞肝癌模型中，巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-10，促进程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）表达，抑制T 细胞杀伤肿瘤细胞[15]。巨噬细胞分泌的TGF-β 促使肿瘤微环境募集Tregs，增强肿瘤微环境的免疫抑制；同时促进CD8+T 细胞表面PD-1 等抑制性分子表达，帮助肿瘤细胞逃逸[16]。极化的M2 型巨噬细胞抑制T 细胞抗肿瘤能力，降低胰腺癌小鼠模型对于化疗的敏感性，药物抑制M2 型巨噬细胞极化，显著提高化疗效果[17]。本研究中发现肿瘤相关免疫细胞浸润和胰腺癌中CCNB2 基因表达呈正相关。构建多因素Cox比例风险模型发现CCNB2 高表达患者预后更差。

CCNB2 在胰腺癌中发挥功能的具体机制不明。袁艺标等[18]报道MKL1 的小RNA 干扰转染细胞后，CCNB2 启动子的表达显著降低，从而抑制肺癌转移。通过蛋白相互作用GO 富集分析发现CCNB2 相关的蛋白，主要富集在有丝分裂细胞周期过程、细胞蛋白质代谢过程的调节等，这些与CCNB2 参与细胞周期的调节有关。KEGG 富集分析预测CCNB2 基因可能通过有p53 信号通路、FoxO 信号通路在胰腺癌发挥功能。除此之外，还可能通过卵母细胞减数分裂、细胞周期、人类免疫缺陷病毒1 感染等途径参与胰腺癌的发生、发展，需进一步研究证实。

综上所述，基于生物信息学分析工具，本研究分析了CCNB2 表达在胰腺癌病情和预后的作用。发现胰腺癌组织中CCNB2 高表达和高甲基化，可能在胰腺癌病情中发挥重要作用，与胰腺癌预后不良相关，有望成为胰腺癌早期诊治的切入点。