右美托咪定对脂多糖致小鼠急性肺损伤及肺泡巨噬细胞自噬的影响

韩杨杨 张益维 应静 周海东

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由多种致病因素引起的临床综合征，包括败血症、严重创伤、急性肺炎和急性胰腺炎。随着病情加重可发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]，其中脓毒症引起的ALI 是导致ARDS 发生的重要原因，由于缺乏有效的防治手段，ALI 发病率和病死率极高[2]。革兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）已被证实可诱发ALI[3]。LPS在体内主要通过单核巨噬细胞启动免疫炎症反应[4]，巨噬细胞作为ALI发病机制中的关键因素已被广泛证明[5]。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）具有催眠、抗焦虑、镇静、镇痛和抗交感等多种作用，可减轻巨噬细胞炎症反应，其具体机制未明。自噬几乎在所有类型的细胞中表达，参与大量天然免疫和适应性免疫反应，并控制其炎症反应过程[6-7]。本研究拟在观察Dex对LPS致小鼠ALI的保护作用及肺泡巨噬细胞自噬的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF 级6 周龄雄性C57BL/6 小鼠30 只[杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0004，合格证号：20220413Abzz0105999861]，体重20～25 g。主要试剂：Dex（扬子江药业集团有限公司，批号：21091031）；LPS（上海源叶生物科技有限公司，批号：J05GS150769）；Western blot 法检测一抗微管相关蛋 白1 轻 链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）B 抗体（美国Abcam 公司，货号：ab48394），二抗辣根过氧化物酶（HPR）标记的山羊抗兔抗体（杭州联科生物技术股份有限公司，货号：GAR0072），βacitin（上海碧云天生物技术有限公司，货号：AF0006）；免疫荧光检测一抗LC3B 抗体（美国Abcam公司，货号：ab192890），二抗羊抗兔IgG H＆L（美国Invitrogen 公司，货号：A21429）；一抗CD68 抗体（美国Santa Cruz 公司，货号：sc79761），二抗羊抗鼠IgG H＆L（美国Invitrogen 公司，货号：A11001）；4',6-二脒基-2-苯基吲 哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Sigma 公司，货号：D9542）。主要仪器：电子天平（南京苏测电子科技有限公司，SC-DC-1200AS 型）；高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1750R 型）；涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器，QL-861 型）；全波长酶标仪（美国Molecular Devices 公司，SpectraMax Plus 384 型）；低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TDZ4-WS 型）；轮转式切片机（德国LEICA 公司，RM2235 型）；病理组织漂烘仪（常州市郝思琳仪器设备有限公司，tec 2500 型）；显微镜（日本OLYMPUS 公司，BX43 型）；隔水式恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司，PYX-DHS500BS-Ⅱ型）；电泳系统（上海Bio-RAD 公司，Mini-Proten Tetra System）；台式低速离心机（湖南凯达实业发展有限公司，TD5A）；激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司，LSM880 型）。

1.2 动物分组及建模 30 只小鼠常规适应性饲养1周后，按随机数字表法分为对照组（Con 组）、LPS 组、Dex+LPS 组，每组各10 只。模型制备前禁食12 h，参照文献[8]腹腔注射LPS 制备ALI 模型。LPS组和Dex+LPS组小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg，Con 组腹腔注射等容量0.9%氯化钠注射液；其中Dex+LPS 组腹腔注射LPS 前30 min 腹腔注射Dex 50 μg/kg，同时Con 组和LPS 组腹腔注射等容量0.9%氯化钠注射液。于造模后24 h 小鼠眼眶取全血约0.6 mL，脱颈处死后取肺组织标本，将右肺组织4%甲醛固定，其余肺组织在-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3 MSS 评分 造模后24 h 观察动物状态，并行小鼠脓毒症评分（murine sepsis score，MSS）[9]，从以下7 个方面进行评分，即外观、意识水平、活动、对刺激的反应、眼睛、呼吸频率及呼吸质量，根据程度按0～4 分打分，将7 项指标得分相加作为总分。（1）外观：被毛光滑0 分；斑片状立毛1 分；背部大部分立毛2 分；有或无立毛、身体出现“肿胀”3 分；有或无立毛、并且小鼠显得憔悴4分。（2）意识水平：小鼠处于活动状态0分；处于活动状态但避免直立1 分；明显活动减慢、仍在走动2分；活动受损，只有被激怒时才会移动并伴有震颤3分；活动严重受损，被激怒时保持静止，可能会震颤4分。（3）活动：正常的活动量，小鼠正在做吃、喝、爬、跑和打架0分；活动轻微抑制，在笼子底部移动1 分；活动抑制，小鼠静止不动，偶尔进行调查运动2 分；没有活动，小鼠静止3分；没有活动，小鼠正在经历震颤，尤其是后腿4分。（4）对刺激的反应：对听觉刺激或触摸反应迅速0 分；对听觉刺激反应迟缓或无反应，对触摸反应强烈（逃跑的动作）1 分；对听觉刺激无反应，对触摸中等反应（移动几步）2 分；对听觉刺激无反应，对触摸轻微反应（没有活动）3 分；对听觉刺激无反应，触摸时反应很少或没有，如果被推倒无法自行纠正4 分。（5）眼睛：睁开0 分；眼睛没有完全睁开，可能有分泌物1 分；眼睛至少半闭，可能有分泌物2 分；眼睛半闭或更多，可能有分泌物3 分；眼睛闭上或混浊不清的4 分。（6）呼吸频率：正常、快速的呼吸0 分；呼吸轻微减少（无法用肉眼测量）1 分；呼吸中等减少（肉眼定量的上限）2 分；呼吸严重减少（频率易用肉眼测量，呼吸间隔0.5 s）3 分；呼吸极度减少（呼吸间隔＞1 s）4 分。（7）呼吸质量：正常0分；短暂的呼吸困难1 分；呼吸困难，没有喘气2 分；呼吸困难伴间歇性喘气3分；喘气4分。

1.4 血清TNF-α、IL-6水平检测 每组随机选取5只小鼠的全血，采用ELISA 法检测小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 肺组织病理检查及肺损伤情况评估 每组随机选取3只小鼠的右肺上叶组织，石蜡包埋切片后进行HE染色，显微镜下观察肺组织病理学变化。参照文献[10]对病理切片显示的肺组织损伤程度进行病理学半定量评分，包括以下4 项指标：（1）肺泡充血；（2）肺泡出血；（3）间隙（肺泡腔）或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；（4）肺泡间隔（肺泡壁）增厚和（或）透明膜形成。各项指标按损伤严重程度进行评分，无损伤或非常轻微损伤为0分，轻度损伤为1分，中度损伤为2分，重度损伤为3分，极重度损伤为4分，将4项指标得分相加作为总分。

1.6 肺组织中自噬相关蛋白（LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ）表达情况检测 采用Western blot 法。每组随机选取3 只小鼠的左肺上叶组织，检测肺组织自噬相关蛋白。提取肺组织蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜封闭，分别与一抗LC3B 抗体（1∶2 000）及二抗羊抗兔IgG H&L（1∶5 000）孵育，TBST 洗膜后ECL化学发光显影，采用凝胶成像系统进行曝光。采用Image J 软件（美国NIH 公司）分析目标蛋白条带灰度值，计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.7 肺组织LC3B 及CD68 表达情况的检测 采用免疫荧光染色。每组随机选取3 只小鼠的右肺下叶标本，进行常规脱蜡水化，枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中微波修复，滴加一抗自噬标志物LC3B 抗体（1∶250）、巨噬细胞标志物CD68 抗体（1∶250），4 ℃冰箱孵育过夜，转至室温平衡30 min，PBS 冲洗3 次，5 min/次；滴加荧光二抗羊抗兔IgG H＆L（1∶100），二抗羊抗鼠IgG H＆L（1∶100），37 ℃孵育60 min，PBS 冲洗3 次，5 min/次；DAPI 染核，甘油PBS 封片，荧光显微镜观察各组小鼠肺组织LC3B 及CD68 表达情况，使用Image-Pro Plus 图像分析软件对结果进行分析，并计算LC3B 与CD68 共定位荧光面积/CD68 荧光面积。

1.8 统计学处理 采用SPSS 26.0 统计软件及Graphpad Prism 9 软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠MSS 评分的比较 Con 组小鼠外观、意识水平、活动、对刺激的反应、眼睛、呼吸频率及呼吸质量正常，MSS 评分为0 分；而LPS 组与Dex+LPS 组小鼠出现了活动减慢，运动减少，呼吸频率减慢，呼吸费力，眼睛有分泌物，对刺激反应迟钝等现象，说明脓毒症造模成功；LPS 组MSS 评分为（22.4±3.4）分，Dex+LPS 组MSS 评分为（21.1±3.3）分，均高于Con 组。造模后24 h 无动物死亡。

2.2 3 组小鼠血清TNF-α、IL-6水平的比较 LPS 组及Dex+LPS 组小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平均高于Con 组小鼠（均P＜0.01），但Dex+LPS 组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明显低于LPS组小鼠（均P＜0.01），见表1。

表1 3 组小鼠血清TNF-α、IL-6 水平的比较（pg/mL）

2.3 3 组小鼠肺组织病理检查结果及肺损伤评分的比较 与Con 组小鼠比较，LPS 组小鼠肺泡结构紊乱，肺组织内出血、损伤严重，肺泡及肺间质有渗出物，且有大量中性粒细胞浸润，肺泡间隔明显增厚；Dex+LPS 组小鼠肺组织损伤程度较轻，肺泡间隔有一定程度的增厚，且中性粒细胞浸润程度也明显低于LPS 组小鼠，见图1（插页）。

图1 3 组小鼠肺组织病理检查所见

Con 组、LPS 组及Dex+LPS 组小鼠肺损伤评分分别为（2.1±0.6）、（10.8±0.8）、（8.2±0.5）分，LPS组及Dex+LPS 组小鼠肺损伤评分均高于Con 组（均P＜0.01），且Dex+LPS组小鼠肺损伤评分低于LPS组小鼠（P＜0.01）。2.4 3 组小鼠肺组织LC3 蛋白表达的比较 与Con 组小鼠比较，LPS 组小鼠中肺组织的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调（P＜0.01），Dex+LPS 组小鼠肺组织的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值低于LPS 组小鼠（P＜0.01），见图2、3。

图2 3 组小鼠肺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比较

图3 3 组小鼠肺组织LC3 蛋白表达的电泳图

2.5 3 组小鼠肺组织免疫荧光染色结果比较 免疫荧光染色结果显示，LC3B 呈红色荧光，CD68 呈绿色荧光，核呈蓝色荧光，见图4（插页）。

图4 3 组小鼠肺组织肺泡巨噬细胞自噬的免疫荧光染色所见

Con 组、LPS 组及Dex+LPS 组小鼠肺组织LC3B 与CD68 共定位荧光面积/CD68 荧光面积分别为0.17±0.06、0.38±0.03 及0.22±0.10，与Con 组小鼠比较，LPS组小鼠中LC3B与CD68共定位荧光面积/CD68荧光面积明显增加（P＜0.01），提示LPS引起肺泡巨噬细胞自噬增强。而与LPS 组小鼠比较，Dex+LPS 组小鼠中LC3B 与CD68共定位荧光面积/CD68荧光面积减少（P＜0.05）。

3 讨论

LPS 是革兰阴性菌的细胞壁组成成分之一，是脓毒症最重要的致病因子之一，是在体和离体脓毒症模型最常用的诱导剂。本研究参照文献采用小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg 成功建立ALI 模型[8，11-12]。在注射LPS 24 h后，与Con 组比较，LPS 组MSS 评分及肺损伤评分均升高。LPS 组小鼠在造模24 h 后出现活动减慢，运动减少，呼吸频率减慢，呼吸费力，眼睛有分泌物，对刺激反应迟钝，体重减轻等现象；病理形态学表现为ALI，肺泡结构紊乱，肺组织内出血、损伤严重，肺泡及肺间质有渗出物，且有大量中性粒细胞浸润，肺间隔明显增厚。Con 组肺组织肺泡壁也存在部分断裂，考虑是切片制备过程导致。肺泡内出血、渗出及炎性浸润少，视野内断裂会更加明显。这与Zhang等[8]研究结果相符。

脓毒症ALI 中，各种吞噬细胞如巨噬细胞，大量聚集于肺中，产生大量炎症因子和趋化因子，引起肺组织过度炎症反应，引起ALI，最终导致ARDS[13]。在脓毒症早期，巨噬细胞被过度激活并释放大量的炎症因子，如IL-6、IL-1、TNF-α 和大量趋化因子如趋化因子配体8-11（CCL8-11）、趋化因子配体2-4（CCL2-4），引起Th1 细胞介导的免疫反应，从而导致炎症反应失控、休克、器官损害[14-15]。自噬又名Ⅱ型程序性细胞死亡，是真核细胞的一个高度保守过程，对维持细胞的正常功能起着至关重要的作用[16]。LC3 是参与形成自噬体膜的重要结构蛋白，在发生自噬过程中，Atg4 将LC3 断开，形成LC3-Ⅰ；LC3-Ⅰ在Atg3 和Atg7 的作用下与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）共价绑定形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ结合于自噬体膜上[17]。LC3-Ⅱ是组成自噬体膜的重要结构蛋白，因此可以用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值来反映自噬水平的高低[17]。本研究中，与Con 组比较，免疫荧光结果显示LPS 组巨噬细胞数量显著增多，外周血血清TNF-α、IL-6 水平均升高。Western blot 法检测结果显示LPS 组肺组织的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调，提示LPS 导致小鼠ALI 出现全身炎症反应增强，自噬增强。

Dex 是一种高选择性的α2 肾上腺素能受体激动剂。本研究参照文献[18-19]，选择在造模前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg。Dex 对LPS 导致的小鼠ALI 具有保护作用[20]。本研究发现，与LPS 组比较，Dex+LPS组小鼠脓毒症评分及肺组织肺损伤评分降低，同时外周血血清TNF-α、IL-6 水平下降，提示Dex 能够减轻小鼠LPS 导致的ALI，抑制炎症反应。目前关于Dex 对LPS 导致的ALI 保护作用的机制研究很多，但没有统一的研究结论。有研究发现Dex 改善LPS 导致的ALI，包括肺的炎症反应、氧化应激以及凋亡，这些保护作用部分与PI3K/Akt/FoxO1 信号通路相关[19]。也有研究证实Dex 通过调节HIF-1α/HO-1 信号通路来维持线粒体融合/分裂的动态平衡，从而改善LPS 诱导的ALI[21]。而另有研究者发现Dex 通过靶向miR-381 介导的NLRP3 表达减轻小鼠LPS 导致的ALI[22]。Ding等[23]发现Dex 和3-甲基腺嘌呤可逆转LPS 导致的ALI，通过减轻炎症反应及自噬，并且抑制TLR4-NF-κB 信号途径。本研究发现，与LPS 组比较，Dex+LPS 组Western blot 法检测结果显示肺组织的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调，自噬减轻；免疫荧光结果显示LC3B、CD68荧光强度减小，提示Dex 抑制自噬增强及巨噬细胞的增多；Merge 图中结果显示，与LPS 组比较，Dex+LPS 组的巨噬细胞自噬减轻。表明Dex 通过抑制炎症反应及巨噬细胞自噬的过度激活对LPS导致的ALI起保护作用。

Dex 通过调控自噬对脏器的保护作用的研究很多，其中Li 等[24]发现Dex 可能通过激活PI3K/Akt 通路上调Beclin1 磷酸化水平，进而减少Atg14L-Beclin1-Vps34 复合物的相互作用，从而减轻心肌过度自噬和心肌损伤。另有研究发现，Dex 预处理可以通过增强自噬抑制炎症反应，改善大鼠肾脏结构和功能，减轻LPS 诱导的AKI，其机制可能与激活a2-AR/AMPK/mTOR 信号通路抑制NLRP3 炎症小体的激活相关[12]。Zhang 等[25]报道在大鼠的肺缺血再灌注损伤模型中，Dex 预处理通过上调HIF-1α 及下调BNIP3 和BNIP3L抑制自噬，从而预防肺损伤。这些研究为Dex调控巨噬细胞自噬保护LPS导致的ALI提供了理论基础。

综上所述，在小鼠LPS 所致ALI 中，Dex 能有效减轻炎症反应，减少肺损伤，该作用可能与Dex 抑制肺泡巨噬细胞自噬的过度激活有关，需要进一步研究来寻找Dex 抑制肺泡巨噬细胞自噬过度激活，保护LPS 所致ALI 的分子机制。