基于网络药理学和分子对接技术探究珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的作用机制

宋欣宏，尚禹东，初孟瑶，程立业，艾长山，陈长宝※，王恩鹏※

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.长春科技学院鹿茸科学与产品技术研究所，吉林 长春 130000）

烧烫伤是一种临床上常见的疾病，一旦发生会给患者带来极大的身心伤害，严重的威胁着人类的健康[1]。烫伤的损伤一般发生在体表，但反应在全身，烫伤愈重，反应愈烈[2]。烫伤会破坏皮肤天然屏障，导致血液循环障碍甚至丧失血液灌注，同时造成局部营养缺乏，全身免疫力下降，为细菌入侵提供便利条件[3]。创面感染发病急、进展快，持续恶化可引起脓毒症（Sepsis）、脓毒性休克（Septic shock）、多器官功能障碍综合征（MODS），甚至死亡[4]。珍珠烧伤膏是一种治疗烧烫伤的医疗机构制剂，历经20 余年40 余万例患者的应用，具有良好的临床疗效和安全性，具备较好的开发价值和市场前景。珍珠烧伤膏具有祛腐排脓、修复组织、生肌敛口、增强免疫、清热解毒、活血祛瘀和消肿止痛的功效[5，6]，方中有黄芩、当归、紫草、白芷、甘草和金银花等药味，诸药相配，可以在烧烫伤治疗过程中，起到辅助缓解疼痛的作用[7]。

网络药理学（Network pharmacology）是基于大数据的分析平台，通过筛选中药中有效化合物成分，结合相关数据库中疾病的相关信息，筛选出药物作用于疾病的靶点及机制网络，对药物作用及机制的相关数据进行挖掘，直观反映药物与疾病的关联程度[8,9]，随着生物信息学的快速发展，网络药理学已成为中医药探索的有力工具[10,11]。分子对接是一项可以利用Auto-Dock 及PyMOL 等软件来模拟配体和受体结合的技术，通过分析其结合能力的大小，从而对网络药理学结果进行初步验证[12]。本研究主要通过网络药理学的方法预测出珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的有效成分、关键靶点及信号通路，然后利用分子对接的方法进行初步验证，为后续研究提供参考。

1 材料及方法

1.1 数据库及软件

TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；Uniport（https://www.uniprot.org/）；DrugBank（https://go.drugbank.com/）；GeneCards（https://www.genecards.org/）；STRING（https://cn.string-db.org/）；Metascape（https://metascape.org/）；Cytoscape 3.8.2；OpenBabel 3.1.1；AutoDock Tools 1.5.7；PyMOL 2.3.2。

1.2 珍珠烧伤膏活性成分筛选

通过TCMSP数据库以金银花、黄芩、白芷、紫草、当归和甘草等为关键词检索化学成分，以药代动力学参数（ADME）为依据[13]，由于珍珠烧伤膏为外用药，因此，不将口服生物利用度列为筛选条件，仅将类药性DL≥0.18 设为筛选条件，过滤获得烧伤膏的止疼活性成分作为研究对象。

1.3 珍珠烧伤膏活性成分作用靶点获取

通过TCMSP 数据库得到1.2 中活性成分对应的靶标蛋白，将靶标蛋白通过UniProt 数据库检索查询其对应的基因名称。

1.4 珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的潜在靶点预测

在DrugBank 数据库、GeneCards 数据库输入“pain”[14]检索获得疼痛的作用靶点。使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/）云平台中的维恩图软件将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的潜在作用靶点。

1.5 构建“药物－活性成分－靶点基因－疾病”网络

将中药材、活性成分及1.4 项下所得的疼痛潜在作用靶点导入Cytoscape 3.8.2 软件，构建“药物－活性成分－靶点基因－疾病”网络图，分析网络拓扑性质，采用“Network analyzer”插件进行数据处理。

1.6 蛋白相互作用网络构建

将1.4 项下潜在靶点导入STRING 数据库，勾选multiple proteins，物种选择Homo sapines，构建蛋白相互作用（PPI）关系图。另外将得到的数据用tsv 的格式导入Cytoscape 3.8.2 软件，运用Cytoscape 软件中CytoNVA插件的betweenness功能，计算网络的介数中心性。

1.7 生物通路富集分析

利用Metascape 数据库（https://metascape.org）对1.4 中获得的共同靶点进行基因本体（gene ontology,GO）功能富集分析，包括生物过程（Biological process,BP）、细胞组成（Cell composition,CC）、分子功能（Molecular function,MF），各筛选前10 条重要通路，用微生信在线网站（http://www.bioinformatics.com）绘制柱状图。同样在该数据库上进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析，设置P-value ＜0.01，筛选前20 条重要通路制作气泡图。最后将上述得到的靶点、通路导入Cytoscape 3.8.2，得到靶点－通路网络图。

1.8 核心活性成分 关键作用靶点分子对接

从PubChem 数据库中获取1.5 中筛选出来的核心活性成分的三维结构并保存为SDF 文件，用Open-Babel 3.1.1 将核心活性成分转化为PDB 文件，再由AutoDock Tools 1.5.7 转化为PDBQT文件；另从RCSB PDB 数据库中获取从1.6 中筛选出来的关键靶蛋白的晶体结构并保存为PDB 文件，用PyMOL 2.3.2 软件去除关键靶蛋白晶体中的水分子并加极性氢，去除活性中心的原配体，将处理后的关键靶蛋白保存为PDB 文件，再通过AutoDock Tools 1.5.7 软件转化为PDBQT 文件，通过AutoDock Tools 1.5.7 软件对处理完的核心活性成分和关键靶蛋白进行对接模拟，最后利用PyMOL 2.3.2 软件作出分子对接图，以直观展示分子对接的结合模式。

2 结果

2.1 珍珠烧伤膏活性成分的筛选

通过TCMSP 数据库，设定DL≥0.18，筛选出符合条件的化合物，检索到黄芩有效成分36 个，当归2个，金银花23 个，紫草12 个，白芷22 个，甘草92 个，筛选去除共有成分，共计156 个（表1）。

表1 珍珠烧伤膏化合物基本信息Table 1 Compounds basic information of Zhenzhu Burn Ointment

2.2 珍珠烧伤膏活性成分作用靶点

通过UniProt 数据库检索到黄芩潜在作用靶点92个，当归潜在作用靶点40 个，金银花潜在作用靶点174个，紫草潜在作用靶点13 个，白芷潜在作用靶点44 个，甘草潜在作用靶点191个，去除重复靶点，共计245个。

2.3 珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的潜在靶点

通过DrugBank 数据库、GeneCards 数据库输入“pain”检索、筛查并整合后获得疼痛的作用靶点1 667个。使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/）云平台中的维恩图软件将珍珠烧伤膏预测的靶点与疼痛的靶点进行映射，获得珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的潜在作用靶点149 个（图1）。

图1 珍珠烧伤膏缓解疼痛潜在靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of a potential target for pain relief from Zhenzhu Burn Ointment

2.4 “药物－活性成分－靶点”网络模型及分析

采用Cytoscape 3.8.2 软件构建“药物－活性成分靶点”网络模型（图2）。该网络共有407 个节点（包括245 个靶点节点，162 个活性化合物节点（包括中药名称），共有2143 条边（每条边代表活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系）。“正六边形”表示药物的活性化合物节点，“菱形”为靶点节点，“正方形”表示中药材名称，由图2 可见，珍珠烧伤膏中各药物之间存在各种相互作用关系，同一成分对应不同的靶点，不同成分也可对应同一靶点，形成复杂的作用网络，也充分体现了珍珠烧伤膏缓解疼痛的多成分、多靶点治疗机制。

图2 “药物－活性成分－靶点”网络图Fig.2 “Drugs Ingredients Targets”network

2.5 蛋白相互作用（PPI）网络

将珍珠烧伤膏缓解疼痛的149 个作用靶点导入STRING 数据库，物种限定为“Homo sapiens”，得到潜在作用靶点的PPI 网络（图3）保存其TSV 格式文件。将文件中的node1，node2，combined score 信息导入Cytoscape 3.8.2 软件，绘制PPI 网络，并进行Network Analyze分析，网络中共包含148 个节点（节点代表靶点），3 075 条边（边代表靶点之间的相互作用），一个有更高介数中心性的节点在网络中有更强的控制能力。运用Cytoscape 软件中的CytoNVA 插件的betweenness 功能计算网络的介数中心性，图中节点越大，颜色越深，则表明度值越大，依次排序为IL6、AKT1、TNF、ESR1、CAV1、SLC6A4、MMP9、IL1B、TP53 和CTNNB1 等。

图3 珍珠烧伤膏蛋白－蛋白互作网络图Fig.3 PPI network of Zhenzhu Burn Ointment

2.6 GO功能富集和KEGG通路分析

将以上靶点导入Metascape 数据库，共得到GO富集条目331 个，其中生物过程（BP）238 个，分子功能（MF）57 个，细胞组分（CC）36 个。BP方面与疼痛相关的生物过程有22 条，选取BP 与疼痛相关的10 个条目、MF 与CC 排名A 前10 位的条目，分别绘制条形图（图4）。BP 主要富集在无机物质反应、细胞对氮化合物反应和对异种刺激的反应等；MF 主要富集在激酶结合、蛋白质结构域特异性结合、氧化还原酶活性和－蛋白质同源二聚活性等；CC 主要涉及膜筏、囊泡腔、转录调节因子复合物、受体复合物和内质网腔等。KEGG通路分析结果，共得到信号通路200 条，其中，与疼痛密切相关的通路有20 条（图5）。

图4 GO 分析生物过程、分子功能和细胞组成情况Fig.4 GO analysis of the biological process,molecular function and cellular composition

图5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

2.7 “活性成分－重要靶点－关键通路”网络模型构建

基于以上结果，获得药物的活性成分、重要靶点和关键通路，导入Cytoscape 3.8.2 软件，构建“活性成分重要靶点－关键通路”网络模型，进行Network Analyze分析，见图6。该网络共有274 个节点，1 509 条边，平均度值是11.01。图6 中节点越大表明度值越大，大于平均度值的活性成分有21 个，分别是槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚和黄芩素等；靶点有27 个，分别是MAPK14、KDR、AKT1、TP53 和CCND1 等；信号通路有11 条，分别是癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路和Hepatitis C 信号通路等。

图6 “活性成分－重要靶点－关键通路”网络Fig.6 Ingredient-Target-Key pathway network

2.8 分子对接

将2.7 网络中度值最大的活性成分槲皮素、木犀草素分别与PPI 网络中确定的4 个关键靶蛋白IL6、AKT1、TNF 和TP53 进行分子对接分析，这些小分子化合物通过氢键结合到目标蛋白上，这是一种静电相互作用，见图7 和表2。结果显示，槲皮素与木犀草素与4 个关键靶蛋白的结合活性均小于 20.94 kJ/mol，表明它们之间具有潜在的结合活性。

图7 分子对接图Fig.7 Molecular docking maps

表2 关键活性分子与靶点对接表Table 2 Docking of key active molecules and targets

3 讨论

为了进一步研究与探讨珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛的药效基础和潜在的生物学机制，本研究利用网络药理学技术筛选出药效靶点，并与疾病靶点结合构建PPI网络，运用基因靶点富集分析及通路预测等手段得到槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山柰酚等核心活性成分。槲皮素（Quercetin）能作用于信号通路相关蛋白。研究发现，槲皮素是广泛的激酶抑制剂，可作用于许多信号转导通路，如PI3K/Akt/PKB通路，酪氨酸激酶、蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[16]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化和抗肿瘤等多种药理活性[18]。汉黄芩素有促进肿瘤细胞凋亡的作用，汉黄芩素还能促进TNF-α诱导的凋亡，联合应用NF-κB 特异性抑制剂或转录、蛋白合成抑制剂（如放线菌素D 和放线菌酮）可增强TNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用。山柰酚（Kaempferol）可以抑制皮肤纤维细胞的氧化应激反应、炎症反应和细胞损伤来改善皮肤细胞的纤维化[15]。

PPI 分析结果显示，珍珠烧伤膏可能是通过IL6、AKT1、TNF 和TP53 等关键蛋白质靶点来辅助缓解疼痛。其中蛋白激酶1（Kinase 1，AKT1）是3 种蛋白激酶之一，参与多个炎症、免疫、代谢和细胞增殖相关的信号通路[17]。AKT蛋白在大多数癌症类型中都高度表达，包括HCC、肺癌、乳腺癌以及结肠癌，其中AKT1是治疗癌症的主要药物靶点，在细胞增殖和抗凋亡的过程中发挥作用。IL6 是机体炎性反应的重要介质，促进炎性反应，导致皮肤表面脓疮肿痛。目前，已知TNF家族中有约30 种生物活性因子，TNF-α与异位内膜的凋亡、基因表达、酶的活性以及激素和细胞因子的作用均是细胞凋亡的基础，所以TNF 可以促进皮肤细胞去腐生肌，进而缓解疼痛。

KEGG 分析发现，珍珠烧伤膏主要通过调控癌症信号通路（Pathways in cancer）、炎症信号通路（TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway）和细胞增殖信号通路（MAPK signaling pathway）等发挥其缓解疼痛的作用。PI3K-Akt 信号通路能够调控萎缩性细胞的损伤程度，当PI3K 激活后，在细胞质膜上产生磷脂酰肌醇三磷酸酯，该蛋白与信号蛋白Akt 和磷酸肌醇依赖性激酶1 结合，后者在细胞中含有PH结构域，导致Akt 激活，从而调节细胞的增殖、分化和凋亡[19]。MAPK 信号通路丝裂活化蛋白酶是一种丝氨酸蛋白激酶，是MAPK 信号通路的枢纽。MAPK 信号通路能将细胞外信号传导至细胞质和细胞核内，参与不同细胞功能的调控，调控细胞增殖、代谢及黏附等过程[20]。以上通路均能促进细胞再生修复，进而缓解疼痛。

综上所述，珍珠烧伤膏可以通过槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山柰酚等核心活性成分，作用于IL6、AKT1、TNF 和TP53 等靶点，调节PI3K-Akt 和MAPK等信号通路来辅助缓解疼痛。本研究通过网络药理学方法对珍珠烧伤膏辅助缓解疼痛进行了系统分析，发现了其潜在的作用靶点，阐明了珍珠烧伤膏活性成分、靶点和通路之间相互作用的关系，可为下一步验证珍珠烧伤膏对于以上预测关键靶点及信号通路影响提供理论依据，为明确其临床作用机理奠定基础。