基于网络药理学和分子对接技术探讨益肠散结汤治疗结直肠癌的作用机制

刘静璇，戴玲玲，谭松，赵啸虎，侯爱画※

（1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014；2.烟台市中医医院肿瘤科，山东 烟台 264001）

结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是世界第三大癌种，在常见癌症死亡原因中，结直肠癌升至第2 位。2020 年，我国CRC 新增患者达55.5 万，在恶性肿瘤中占第3 位[1]。流行病学提示，过去三十年内，全球大部分地区CRC 疾病发病率、死亡率和早发率大幅增高[2]。据估计，至2040 年全球结肠癌和直肠癌新增病例将分别达到192 万和116 万[3]。目前，CRC 治疗方式涉及手术、辅助放化疗和靶向治疗等，但其治疗伴随的毒副作用及生活质量下降等问题仍不可忽视[4]。

中医药抗肿瘤效果已在临床中得到证实，此外中药涉及多靶点和多信号途径的抗肿瘤机制。中医无“结直肠癌”之病名，其对该病的论述散见于“积聚”、“肠蕈”、“脏毒”、“下痢”、“便血”和“锁肛痔”等。中医认为CRC 内因以正气虚损为主，外因为邪毒入侵；病机为本虚标实，正虚以脾虚为代表，以“痰湿瘀毒”为标[5]。根据以上病因病机认识及临床经验，烟台市中医医院肿瘤科以“健脾化痰，清热解毒袪瘀”为治疗CRC 基本治则，拟定益肠散结汤（党参，白术，茯苓，女贞子，浙贝母，山慈菇，露蜂房，北豆根，郁金，枳壳，蛇莓和藤梨根）。前期临床研究表明，益肠散结汤具有改善CRC患者症状，降低肿瘤标志物水平，减轻化疗毒副反应和提高生活质量的作用[6]。

网络药理学基于生物网络，分析药物靶点，探究成分靶点－疾病网络之间的机制，揭示复杂疾病与中药配方之间的生物学基础[7]。本研究基于以上技术，初步研究益肠散结汤潜在治疗CRC 的作用机制，为进一步临床和试验研究拓展思路。

1 材料与方法

1.1 筛选益肠散结汤活性成分及其靶点

在中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）输入各中药名检索，筛选条件为口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%、类药性（drug likeness,DL）≥0.18。TCMSP 数据库未收录成分，则使用Batman-TCM 数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/）补充。TCMSP 获取活性成分相关治疗靶点蛋白数据，缺少靶点数据的成分则使用Swiss Target Prediction网站（http://swisstargetprediction.ch/）补充治疗靶点，靶点筛选标准为置信度（Probabilty）=1。

1.2 获取CRC疾病靶点

在Drugbank 数据库（https://go.drugbank.com ）、Therapeutic Target Database 数据库（https://db.idrblab.org/ttd/）与Gene Cards 数据库（https://genecards.org/），以“colorectal cancer”、“colorectal carcinoma”和“colon cancer”为关键词检索，获取CRC 相关疾病靶点。

1.3 构建中药－成分－靶点－疾病网络

将CRC 靶点、益肠散结汤靶点导入Venny2.1，取交集靶点。中药、成分与各靶点创建网络映射，Cytoscape 3.7.1 软件用于可视化“结直肠癌－益肠散结汤靶点网络图”。

1.4 构建靶蛋白相互作用网络

利用STRING 数据库（https://string-db.org），筛选标准为置信度（Medium confidence）=0.700，获取交集靶点的蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）数据，使用Cytoscape 3.7.1 软件可视化PPI 网络图，使用度值（Degree）确定PPI 网络的核心节点。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

运行R 3.6.2 的“cluster Profiler”包，设置筛选标准为FDR 法校正P ＜0.05，对交集靶点作基因本体论（Gene ontology,GO）和京都基因及基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析，结果使用气泡图显示。

1.6 分子对接

在AutoDock 软件内导入木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素和槲皮素共6 个小分子活性成分及TNF、EGFR、TP53 和IL6 共4 个核心靶点结构文件，通过Autogrid、AutoDock 程序（设置半柔性对接），使用Lamarckian GA 算法后进行对接，exhaustiveness 设为8，输出的最大构象数设为9，统计对接结合能情况，并使用PyMOL 软件可视化。

2 结果

2.1 益肠散结汤活性成分及其靶点的筛选结果

使用TCMSP 数据库，Batman-TCM 数据库查询并补充“党参”、“白术”、“茯苓”、“女贞子”、“浙贝母”、“山慈菇”、“露蜂房”、“北豆根”、“郁金”、“枳壳”、“蛇莓”和“藤梨根”成分，整理筛选后，获取76 个具有靶点的活性成分（表1），其对应靶点共188 个。

表1 益肠散结汤活性成分表Table 1 Table of active components in Yichang Sanjie decoction

2.2 CRC靶点获取与交集靶点结果

检索“Genecards”、“Drugbank”和“Therapeutic Target Database”数据库获取疾病靶点并去重，获取11 853 个疾病靶点。将药物、疾病靶点导入Venny 2.1在线工具，获取交集靶点153 个，见图1。

图1 益肠散结汤与CRC 交集基因韦恩图Fig.1 Venn diagram of Yichang Sanjie decoction and colorectal cancer intersection gene

2.3 网络可视化

通过Cytoscape 3.7.1 软件，构建图2，图中矩阵为靶点，绿色菱形为中药，其余节点为药物成分，节点共有276 个，连线共有1 219 条。活性成分中度值前10位的分别为槲皮素（A7）、β-谷甾醇（A3）、光千金藤定碱（BDG8）、碎叶紫堇碱（BDG4）、豆甾醇（A2）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（DS4）、木犀草素（A1）、光千金藤碱（BDG7）、常春藤皂苷元（FL9）和柚皮素（A6）。

图2 结直肠癌－益肠散结汤靶点网络图Fig.2 Colorectal cancer-Yichang Sanjie decoction-target network diagram

2.4 PPI网络构建和核心蛋白筛选结果

PPI 网络（图3）提示，存在131 个节点，547 条连线，节点度值均值为8.35，图谱使用节点大小和颜色深度表示度值差异。图4 结果显示，度值排序前15 的靶点，分别是转录因子JUN（TranscriptionfactorJun,JUN），编码p53 蛋白（Tumor Protein P53,TP53），表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR），白介素6（Interleukin 6,IL6），肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF），促分裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase3,MAPK3），白介素-1β（Interleukin-1 beta,IL1B），雌激素受体（Estrogen receptor,ESR1），促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1），血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA），环氧合酶2（Prostaglandin-endoperoxidase synthase 2,PTGS2），基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP9），促分裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8），促分裂原活化蛋白激酶14（Mitogen-activated protein kinase14,MAPK14），表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF），见图4。

图3 共同靶点蛋白互作图Fig.3 Protein-protein interaction network mapping of mutual targets

图4 度值前15 位靶点Fig.4 The top 15 targets

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析

利用R3.6.2 软件“cluster Profiler”包进行分析，图5 中以气泡图展示，其中-lgP值越大气泡颜色越红，数目即为富集基因数目，基因比率为该途径富集基因数占总基因数比率。GO 功能结果涉及2 244 条生物过程，126 条细胞组成、203 条分子功能，KEGG 结果涉及171 条通路。图5 显示各功能的前5 位富集结果与筛选得到的密切相关通路5 条。

图5 GO 功能与KEGG 通路富集分析Fig.5 The enrichment analysis of GO function and KEGG pathway

2.7 分子对接结果

选取槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚和柚皮素共6个小分子活性成分及TNF、EGFR、TP53、IL6 共4 个核心靶点进行分子对接，进一步探究其作用效果。对接靶点与分子的具体对接信息，见表2。结合能排名前5 位的是TNF 与β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚和豆甾醇。分子对接分析得到：β-谷甾醇与TNF A 链的Q102 和R103，C 链的Q102 和E104存在疏水作用；木犀草素与TNF A 链的氨基酸残基E116、B 链的Q102、C 链E104 形成3 条氢键，与A链Q102 存在疏水作用；槲皮素与TNF A 链的氨基酸残基P100 和Q102，B 链的K98 和S99、C 链E104形成6 条氢键，与B 链Q102 存在疏水作用；山柰酚与TNF A 链的氨基酸残基S99，B 链的Q102、C 链P100 和E116 形成5 条氢键，与A 链的Q102，C 链的Q102，B 链的E104 存在疏水作用；豆甾醇与TNF A 链Q102，B 链的Q102、R103 和E104，C 链的Q102、E104，存在疏水作用，见图6。

图6 分子对接图Fig.6 Molecular docking diagrams

表2 分子对接信息表Table 2 Molecular docking information table

3 讨论

本研究基于网络药理学技术对益肠散结汤的多种中药成分及其潜在作用靶点与通路进行分析，获取高度值成分、靶点及密切相关信号通路。结果显示槲皮素、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇和常春藤皂苷元等成分，TP53、EGFR、TNF、ESR1、VEGFA、PTGS2 和EGF等靶点，IL-17信号通路，肿瘤坏死因子信号通路，Th17细胞分化通路，HIF-1 信号通路等可能与益肠散结汤治疗CRC 的机制相关。

槲皮素、木犀草素和柚皮素是黄酮类化合物，其中槲皮素通过阻断Akt-CSN6-Myc信号轴活性抑制HT-29人结肠癌细胞凋亡[8,9]。槲皮素亦能作用于内源性大麻素受体（Endocannabinoids receptor,CB1-R）抑制Caco2与DLD-1 两种人结直肠癌细胞系的增殖[10]。此外Lin等[11]研究表明，槲皮素可通过抑制基因组稳定性调控核心激酶（Ataxia-telangiectasia mutated kinase,ATM kinase）活性，增强人结直肠癌DLD-1 细胞裸鼠移植瘤模型对放疗的敏感性。Krifa 等[12]研究表明，木犀草素通过触发多聚ADP 核糖聚合酶（Poly-ADP-ribose polymerase,PARP）分裂，诱导BE 人结直肠癌细胞凋亡，并上调肿瘤抑制基因p16 表达。此外Yoo 等[13]研究表明，木犀草素通过p53 依赖性途径诱导HCT116人结肠癌细胞自噬与凋亡。柚皮素阻滞SW1116 和SW837 两种人结直肠癌细胞的细胞周期，并上调其促凋亡基因，下调抗凋亡基因及促生存信号通路的表达[14]。Wang 等[15]研究表明，β-谷甾醇通过抑制乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP）的表达，恢复奥沙利铂对耐药HCT161 细胞的敏感性，此外在该耐药细胞系移植瘤小鼠模型中，β-谷甾醇可协同奥沙利铂抑瘤。常春藤皂苷元能破坏线粒体膜电位，从而诱导LoVo 人结直肠癌细胞凋亡[16]。

TP53，亦称p53，是一种重要的抑癌基因，能接收癌症相关的应激信号，包括高ROS 水平、DNA 损伤、癌基因激活、端粒缩短和缺氧等，促使肿瘤细胞死亡、衰老或分化，从而预防肿瘤发展[17]。EGFR 是EGF 的受体，其功能涉及细胞增殖、分化和存活，而EGFR 靶向治疗在多瘤种治疗中已广泛应用[18,19]。EGFR 是CRC 患者常见突变类型，EGFR 的单克隆抗体西妥昔单抗与帕尼单抗，可以延长10%～20%复发转移CRC患者的生存期[20]。Nagasaki 等[21]研究表明，结肠癌基质成纤维细胞可增强IL6 产生，以增强成纤维细胞VEGF 产生，从而诱导肿瘤血管生成。TNF-α是TNF家族的重要成员，涉及多种细胞途径，包括细胞增殖、分化和死亡，参与肿瘤的局部血管侵袭以及肿瘤血管系统的破坏[22]。Hader 等[23]研究表明，早期CRC 患者淋巴结ESR1 启动子的甲基化可能作为CRC 局部复发的标志物。Liu 等[24]发现m6A 甲基化的上皮细胞激酶（Ephrin type-A receptor 2,EphA2）与VEGFA 可通过胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2/3（Nsulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein 2/3,IGF2BP2/3）调节PI3K/AKT/mTOR 和ERK1/2 信号通路，促进CRC中血管生成拟态的形成。PTGS2 普遍由发挥屏障功能的肿瘤相关成纤维细胞表达，其有利于抗肿瘤M1 巨噬细胞群发挥作用。Vene 等[25]研究表明，肿瘤基质细胞中PTGS2 的表达可以对结直肠癌患者总生存率具有保护作用。

IL-17 信号通路中IL17A 可促进CRC 细胞表达VEGF 促进血管生成[26]。TNF 信号通路已被证实与CRC 细胞的迁移和侵袭密切相关，其中TNF-α可通过ERK1/2 信号通路上调肿瘤相关钙信号转导蛋白2（Tumor-associated calcium signal transduction protein-2,TROP-2），显著增强了结肠癌细胞的迁移和侵袭。另一项研究提示TNF-α可激活JNK信号通路诱导HCT116细胞DNA 损伤[27,28]。此外IL-17 与TNF-α亦分别可单独激活NF-κB 和ERK1/2 信号，以上调PD-L1 在人结直肠癌HCT116 细胞中的表达[29]。Th17 细胞是能分泌IL-17 的T 细胞亚群，TGF-信号转导促进Th17 细胞产生IL-22，从而促进CRC 发展[30]。Garzon等[31]研究表明，肿瘤细胞内源性HIF-1α可诱导异常血管生成并与TRAF6 信号通路相互作用，对CRC 的发生产生影响，此外Dong 等[32]经体内、外试验研究，提示HIF-1α诱导的代谢重编程是由ROS/PI3K/Akt 与Wnt/β-catenin 信号通路激活，以导致CRC 对5-氟尿嘧啶的耐药。

4 结论

综上所述，本文基于中药数据库相关数据，通过网络药理学分析，分子对接初步验证与文献回顾，初步证实槲皮素、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素与TP53、TNF、IL6、EGFR 可能在益肠散结汤治疗CRC 中具有重要作用，IL-17 信号通路、TNF 信号通路等通路为潜在作用通路，益肠散结汤多成分、多靶点、多通路治疗结直肠癌的作用机理。但网络药理学方法亦存在局限性，其结果后续需通过药理试验进行验证。