北细辛产地加工参数优化及活性评价

焉学倩，巩金壮，何建暄，王英平,2，张 瑞,2※

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 132118；2.国家作物种质资源长春观测实验站，吉林 长春 132118）

关键字：北细辛；产地加工；镇痛

细辛为马兜铃科植物北细辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]、汉城细辛（Asarum sieboldii Miq.var.seou1ense Nakai）或华细辛（Asarum sieboldii Miq.）的干燥根和根茎，前2种习称“辽细辛”[1]。细辛首载于《神农本草经》，被列为上品，是常用中药[2]。细辛性温，味辛，具有温肺化饮、祛风散寒、通窍和止痛的功效，主治风寒感冒、头痛、痰饮、咳喘、鼻塞、牙痛及风湿痹痛[1,3]。古今文献均记载细辛药用部位为其根部。南北朝《本草经集注》载有“用之去其头节”，即除去其根茎芦头部位。雷敩《雷公炮炙论》中记载“凡使，一一拣去双叶，服之害人”[4]。雷敩提出细辛叶对人有害，并提出要除去头节，说明当时医家已发现细辛的地上部位毒性较大，故将其除去。《中国药典》2020 版[1]规定细辛的主要药用部位为根及根茎，与传统记载不符[5]。

本研究以花期采集的细辛样品为研究对象，研究不同去芦长度对北细辛挥发油、细辛脂素、总灰分和酸不溶灰分等指标的影响，并对最佳切制工艺基础上的北细辛进行镇痛效果的药效学评价。贾凌云等[6]研究不同产地及不同采收期的细辛挥发油和甲基丁香酚的含量，结果表明，挥发油含量在9 月份达到最高。蔡少青等[7]研究不同年份及采集时间对北细辛挥发油的影响，结果显示，总挥发油含量在4、5 和9 月含量最高，本研究前期试验结果显示挥发油含量在7、8 和9 月份含量最高但无显著性差异，故本试验选择7 月27日采集的果后期北细辛作为镇痛效果的研究材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选取6 年生北细辛样品，采自于吉林省通化市柳河县五风轮村（东经125°37'56''，北纬41°97'5''）北细辛规范化种植基地，每个采样点2 m2，将每5 个采样点采集的北细辛混合，作为一个重复，一共3 个重复。北细辛经吉林农业大学中药材学院王志清副教授鉴定为马兜铃科植物北细辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag]。北细辛饮片购买自龙康药业有限公司。

试验动物品种品系为KM 小鼠，雄性，繁殖方式为封闭群，微生物等级为SPF 级，体重（20±2）g，购自于长春生物制品研究所有限责任公司，试验动物使用许可证号：SCXK（吉）-2017-0005；饲养于吉林农业大学动物实验研究中心，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，自由饮水，12 h 光照，标准饲料喂养。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 采收后将北细辛冲洗干净，自细辛根部密集处向下分别切除芦头0.5cm、1.0cm和1.5cm，趁细辛新鲜时切制称为鲜切，将细辛阴干后切制称为干切。

1.2.2 样品的制备 采用煎煮法，取北细辛药材粉碎过2 号筛，取50 g 加10 倍量的蒸馏水浸泡30 min，文火煎煮45 min，四层纱布过滤得滤液A，滤渣加8倍量的蒸馏水，文火煎煮30 min，四层纱布过滤得滤液B，合并2 次水煎液，高速冷冻离心机离心10 min，取上清液于真空冷冻干燥机冷冻干燥成冻干粉，备用。

对照品的制备称取0.100 g 阿司匹林药片，溶于蒸馏水中，用容量瓶定容至100 mL，备用。

1.2.3 总挥发油含量的测定 分别称取不同采收期的细辛粉末20 g（精确至0.01 g），记为X1，置于1 000 mL 的圆底烧瓶中，加蒸馏水400 mL，玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器和回流冷凝管。电热套加热至沸腾，并保持微沸5 h，至测定器中油量不再增加，停止加热，按照规定读取挥发油体积读数为X2，计算挥发油的含量%，记为Y。计算公式为：Y=X2/X1×100%

1.2.4 总灰分的含量测定 总灰分的测定，参照《中国药典》2020 版[1]，总灰分测定法。

1.2.5 酸不溶灰分的含量测定 酸不溶灰分的测定，参照《中国药典》2020 版[1]酸不溶灰分测定法。

1.2.6 醇溶性浸出物的含量测定 醇溶性浸出物的测定，参照《中国药典》2020 版[1]，醇溶性浸出物测定法。称取过二号筛供试品粉末3 g 记为m1（g），精密称定，置于锥形瓶中，加入95%的乙醇75 mL，密塞，称重，静置1 h，连接回流冷凝装置，置于水浴上加热致沸腾，保持微沸的状态1 h。冷却后，用95%的乙醇补足减失的重量，混合均匀，过滤，量取25 mL 置于恒重的蒸发皿中，蒸发皿重记为m0（g），水浴蒸干后，放置于105 ℃的电热鼓风干燥箱中干燥3 h，于干燥器中干燥0.5 h，迅速精密称定重量记为m2（g），计算浸出物的含量（%）记为Y。计算公式为：Y=[（m2－m0）×100]/25 m1×100%

1.2.7 北细辛细辛脂素的含量测定 细辛脂素的测定，参照《中国药典》2020 版的方法[1]。标准曲线的制备：取制备好的对照品溶液（50μL、11μL、14μL、17μL 及20μL。以峰面积为纵坐标，细辛脂素的进样量（μg）为横坐标，计算得回归方程为：y=97.083 1x 76.029 1（相关系数R2=0.999），线性范围0.4～1μg。

图1 液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram

1.2.8 热板试验 选择雄性KM 小鼠置于温度设定为55.0 ℃的智能热板仪上，以小鼠出现舔后足、跳跃反应为指标，记录小鼠在热板上首次出现的时间为痛反应潜伏期。试验前30 min 测定2 次，潜伏期取平均值作为基础阈值（baseline latency,BL），取潜伏期在5～15 s 内的小鼠，将小鼠随机分组，每组10 只。设生理盐水对照组（NS，20 mL/kg）、阿司匹林阳性对照组（0.02 g/kg），6 年生北细辛（生药量2 g/kg）及市场细辛提取冻干粉均用娃哈哈纯净水溶解成混悬液。测定给药后30 min、60 min、90 min 和120 min 的痛阈值。超出60 s 的按60 s 记，记录数据[8]。公式如下：

1.2.9 醋酸扭体试验 选择雄性小鼠，随机分4 组，每组10 只，设生理盐水对照组（NS，20 mL/kg）、阿司匹林阳性对照组（0.02g/kg）、6 年生细辛（生药量2g/kg）与常规细辛提取液冻干粉，用娃哈哈纯净水溶解成混悬液。小鼠灌胃给药35 min后，腹腔注射0.6%的醋酸（由高浓度到低浓度逐渐稀释）0.2 mL。小鼠将有躯干伸张、腹部内凹和臀部抬高等扭体表现。注射醋酸后，记录15 min内的扭体次数作为疼痛反应的指标[9]。公式如下：

2 数据处理与分析

本试验过程中，每个试验数据重复3 次，求平均值，得出数据采用Excel、DPS 9.01 统计软件处理并进行差异性及相关性分析，字母标记法表示在5% 差异显著性。

3 结果与分析

3.1 不同切制处理及干切、鲜切对北细辛挥发油含量的影响

对已去除地上部分的北细辛样品，进行根部着生点向下分别切除0.5 cm、1.0 cm 和1.5 cm 的芦头，试验通过不同切制长度，探究不同切制处理后对根部挥发油的含量影响。北细辛切制加工过程，切制后在根部会形成切断面，通过检测阴干后切制和趁鲜切制后挥发油的含量，比较鲜切和干切对挥发油含量的影响，并进行显著性分析。由表1 可知，6 年生不同切制处理的北细辛挥发油的含量表现为切1.5 cm 处理根中挥发油含量最高，显著高于切1.0 cm、0.5 cm 和未切制处理的。鲜切和干切细辛挥发油含量无显著性差异。细辛芦头重量占比较大，通过前期试验发现其芦头中挥发油含量较低，在花期其含量为0.33%，远低于药典中规定挥发油含量，所以在去除芦头后细辛须根中挥发油含量增加。

表1 6 年生不同处理的细辛挥发油差异性分析Table 1 Analysis on the difference of volatile oil of of 6 years old with different treatments

表1 6 年生不同处理的细辛挥发油差异性分析Table 1 Analysis on the difference of volatile oil of of 6 years old with different treatments

注：字母不同表示有显著性差异，字母相同表示无显著性差异（P ＜0.05）。Note:Different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level ＜0.05.

3.2 不同切制处理的细辛对总灰分含量的影响

由图2 可知，6 年生北细辛经切制处理后总灰分的含量发生了显著变化，未切制处理总灰分含量最高显著高于切制处理。切1.0 cm 和切1.5 cm 的总灰分含量最低，显著低于未切制和切0.5 cm处理，切1.0 cm和切1.5 cm 无显著性差异。细辛是须根植物，生长年限越多夹杂的泥沙越多，经切制处理后取出了芦头部分可以减少泥沙的夹杂，使灰分减少，切1.0 cm 基本把细辛芦头切掉只剩须根部分，所以切1.5 cm 与切1.0 cm 总灰分无显著性差异。

图2 6 年生细辛不同切制处理的细辛根部总灰分的影响Fig.2 Effect of different cutting treatments on the total ash content of 6 years old root

3.3 不同切制处理的细辛对酸不溶灰分含量的影响

由图3 可看出，6 年生北细辛经切制处理后酸不溶灰分的含量发生了显著变化，未切制处理酸不溶灰分含量最高，与切0.5 cm处理无显著性差异，切1.0 cm和切1.5 cm 处理酸不溶灰分含量显著低于未切和切0.5 cm 处理，切1.0 cm 处理与切1.5 cm 处理酸不溶灰分无显著性差异。

图3 6 年生细辛不同切制处理的细辛根部酸不溶灰分的影响Fig.3 Effects of different cutting treatments on acid insoluble ash content of 6 years old root

3.4 不同切制处理的细辛对细辛脂素含量的影响

细辛脂素对病毒和结核杆菌具有良好的拮抗作用，细辛脂素是细辛的指标成分之一。由图4 可知，6年生北细辛经切制处理后细辛脂素发生了显著变化，表现出未经切制处理的细辛脂素的含量最低，显著低于切制处理。切1.0 cm 和切1.5 cm 处理细辛脂素含量显著高于未切和切0.5 cm处理，二者无显著性变化。切制处理减少细辛杂质的含量，由于去除了芦头，据前期研究表明芦头部分细辛脂素含量显著低于细辛须根部分。在花期细辛脂素在芦头含量为0.09%，须根部分含量为0.14%，所以切制处理后细辛脂素含量升高。

图4 6 年生细辛不同切制处理对细辛脂素的影响Fig.4 Effects of different cutting treatments of 6 years old on asarum lipids

3.5 6年生北细辛不同切制长度醇溶性浸出物含量差异

由图5 可知，6 年生北生细辛经切制处理后醇溶性浸出物的含量发生了显著变化，切1.5 cm的含量最高，切1.0 cm处理北细辛根醇溶性浸出物的含量高于未切组和切0.5 cm 处理，未切组和切0.5 cm 组无显著性差异。

图5 6 年生不同处理的北细辛醇溶性浸出物的影响Fig.5 The content difference of alcohol-soluble extract of 6 years old chinensis with different treatments

3.6 不同采收期6年生北细辛与市场售细辛水煎剂对热刺激痛的影响

对果后期北细辛及市场售北细辛进行水煎剂的制备，利用智能热板仪对小鼠进行致痛，比较不同细辛水煎剂对小鼠疼痛的作用效果。表2 结果表明，2 种细辛水煎剂对不同时间检测的小鼠痛阈值均有明显的提高，各给药组的痛阈值均呈现先升高后降低的趋势。30 min 时痛阈提高速率较缓，镇痛效果不佳。各给药组在给药后90 min 时痛阈值达到峰值，药效发挥至最佳，120 min 时痛阈值显著下降。不同时间段均显示果后期的北细辛在小鼠热板试验中镇痛效果最佳。

表2 细辛水煎剂对热板引起小鼠疼痛模型的影响（）Table 2 Effect of decoction on pain model induced by hot plate in mice ()

表2 细辛水煎剂对热板引起小鼠疼痛模型的影响（）Table 2 Effect of decoction on pain model induced by hot plate in mice ()

注：同一列字母不同，差异显著（P ＜0.05）。Note:different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level (P ＜0.05).

3.7 不同采收期6年生细辛与市场售细辛镇痛抗炎的效果

检测果后期北细辛与市场售北细辛水煎剂对醋酸引起的小鼠扭体反应的抑制作用效果，见表3。试验结果表明，不同细辛水煎剂给药组均可减少醋酸导致的小鼠扭体次数，相比于生理盐水组各给药组对醋酸引起的疼痛反应均有抑制作用，有显著性差异，具有统计学意义。研究表明，2 种细辛水煎剂对小鼠扭体的抑制作用为果后期采集的北细辛效果最好，抑制率为30.67%，优于市场售常规饮片。

表3 细辛水煎剂对醋酸引起小鼠疼痛模型的影响（)Table 3 Effects of decoction on acetic acid-induced pain model in mice ()

表3 细辛水煎剂对醋酸引起小鼠疼痛模型的影响（)Table 3 Effects of decoction on acetic acid-induced pain model in mice ()

注：同一列字母不同，差异显著（P ＜0.05）。Note:Different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level(P ＜0.05).

4 讨论

中药材中富含蛋白质、多酚以及糖类等亲水性大分子，水分含量过高容易导致中药材发生霉变，影响中药材的质量，而灰分含量可反映药材的洁净程度及金属矿物质水平[10,11]。《中国药典》2020 版[1]规定细辛水分的含量不得过10.0%，总灰分不可超过12.0%，酸不溶灰分不得超过5.0%，醇溶性浸出物不可少于9.0%，细辛脂素的含量不少于0.05%，挥发油不得少于2.0%[1]。规定同为根和根茎入药的玉竹药材总灰分含量不得超过3.0%，人参中总灰分的含量不得超过5.0%，由此可见，细辛中总灰分的含量较人参和玉竹等药材高，杂质含量的高低影响药材质量。总灰分是药材经过高温灼烧残留的无机物，酸不溶性灰分主要是不溶于稀盐酸的硅酸盐类化合物[12]。灰分和酸不溶性灰分主要和药材中夹杂的泥土砂石有关[13]。为改善药材的质量，对北细辛药材加工参数进行优化，试验数据表明，切制处理后的北细辛总灰分的含量显著下降，其中切除芦头1.0 cm 和1.5 cm 的细辛总灰分含量显著低于未切处理和切0.5 cm 处理的，符合预期。综合各项检测指标以及切制后北细辛根部得率，减少药材损失，选择切除芦头1.0 cm 为最佳切制处理，以保证加工后的经济效益。

研究表明，药材经采集净制后进行鲜切处理，在根部形成了切断面进行阴干，或者北细辛药材经阴干后再进行切制处理，两种方式处理后的北细辛对挥发油的含量无显著性影响，说明切制鲜品北细辛形成的断面不会造成挥发油明显的损失。经不同切制长度处理的北细辛挥发油的含量存在显著性差异，随着北细辛的生长芦头部分包裹较多的杂质及泥沙较难清洗干净，相同提取条件下切制长度的不同导致灰分含量不同从而影响了挥发油、细辛脂素以及醇溶性浸出物的含量，芦头部分挥发油、细辛脂素、醇溶性浸出物的含量较根低，亦或是北细辛自芦头向下成分的分布存在差异，根系分泌物和代谢产物存在差异有待进一步研究。

在最佳切制工艺下，与市售细辛饮片水煎剂进行镇痛效果的对比研究结果显示，经切制处理后的北细辛饮片较市场售细辛饮片镇痛效果佳，说明去芦加工后的北细辛在成分和药效上均优于市场售常规饮片。