微流控技术和智能手机在分析化学实验教学中的应用探索——以磷钼蓝比色法为例

郭锦秀,龙海涛,胡 冰,何 浪,贾利蓉,孔 涛

(甘肃农业大学 理学院,甘肃 兰州 730070)

微流控技术起源于20世纪90年代末,是一种在微纳米尺度的空间中进行流体精确操控的科学技术,具有将常规实验室中诸如样品处理、混合、反应、分离和检测等多种功能集成到一个微小芯片上的能力[1-2].作为分析化学的重要分支和科技前沿技术之一,在大学分析化学的实验教学中适当增加微流控技术的相关内容是十分必要的.从化学实验课的思政建设出发,微流控技术可以显著降低实验成本、缩短实验时间、减少污染排放,体现了科学发展观,是当前科技前沿领域中的绿色技术之一;从化学实验课的教学目的出发,微流控技术的引入,有利于培养学生的动手和观察能力,开拓学生的科学思维和视野,激发学生的学习和创新意识;从微流控技术的发展现状来看,基于微流控芯片的商业化仪器已经出现,微流控的重要性已得到了诸多领域科研工作者的广泛认同,各种材料廉价、操作简单、设备要求低的微流控芯片的加工技术相继出现,关于微流控分析的理论已较为完善[3-4].基于以上原因,在大学化学实验教学中引入微流控技术的条件已经成熟.

如今智能手机通过各种软件,可以实现高清拍照、图像处理、光线感应、重力传感、数据传输等功能,这为智能手机应用于实验教学提供了可能[5].智能手机便携化、集成化、智能化等特点和微流控技术的初衷不谋而合,可以为微流控芯片提供一个低成本便携式的检测平台.

基于微流控芯片和智能手机比色传感的现场即时检测技术(point-of-care test, POCT)已被证明在生物医学、食品安全和环境监测等领域具有良好的发展前景.自从2008年,Martinez等[6]利用智能手机在纸基微流控芯片上对人体尿液中葡萄糖和蛋白质浓度实现比色检测之后,基于智能手机和微流控芯片的比色检测平台发展迅速.2021年,中国农业大学林建涵团队[7]研制了一种集成的微流控比色生物传感器,通过智能手机App对颜色进行处理来确定细菌的数量.最近Nature报道了一种利用3D打印技术构建的微流控芯片平台,配合智能手机可以用作光电探测器,实现了包括冠状病毒SARS-CoV-2在内的一系列生物靶点的检测[8].

1 实验设计思路

磷钼蓝比色法是大学分析化学实验中磷或磷酸盐含量测定的常用方法,以往的教学都是在样品处理后加入钼锑抗混合显色剂,待显色后使用分光光度计进行定量分析,但实际操作中存在浓硫酸用量大、显色随时间变化等问题[9],导致实验的安全性和结果的规律性大打折扣.微流控芯片的微量和集成优势可以有效减小包括浓硫酸在内的试剂用量,消除由于显色时间的差异造成的误差,显著提高分析效率,不仅能够提高磷钼蓝比色法的安全性、准确性、高效性,同时也能够增加实验教学中的趣味性和前沿性.

用于制作塑料微流控芯片的金属丝热压法操作成本低、难度小,适用于本科生实验教学.用该方法制备集成有多个微混合器结构的微流控芯片,并将其用于磷酸盐标准溶液和待测溶液的同时显色,使用智能手机拍摄显色照片并通过手机软件ColorMeter提取不同浓度磷酸盐呈现出的RGB(三基色)值,根据灰度与RGB的数值关系,建立灰度-磷酸盐浓度的标准曲线,实现待测溶液中磷含量的测定.

2 实验原理

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)因其优越的光学透明度、抗腐蚀性、价格低廉等优势,成为了制作微流控芯片常用的聚合物材料[10].热压法是一种操作简单的微通道快速加工和复制技术,模具可以简单到微米级直径的金属丝,在加热软化的聚合物上放阳模加压,即可压制出微通道,将有通道和储液池的基片和盖片加热封接,可制得微流控芯片[11].

由于微米级的结构,流体在微流控芯片中可以显示出与宏观尺度中不同的特殊性质,比如雷诺数的减小.微流控芯片通道中流体的雷诺数通常小于2 000,其中的流体将平行流动而不发生混合,但是不同组分的充分混合是化学反应的前提.为了实现微通道内快速且充分的混合,可以通过设计合适的通道几何形状以增大不同流体的接触时间或接触面积.利用金属丝热压法制备的双螺旋通道结构被证明可以有效提高微通道中的混合效率[12].

在含有磷酸根的酸性介质中,加入钼酸铵和酒石酸锑钾,会反应生成黄色的锑磷钼杂多酸,该产物加入抗坏血酸后会被还原成钼蓝,钼蓝颜色的深浅与PO43-含量成正比,故可用比色法对磷酸盐含量进行测定.在一个集成多个双螺旋通道的微流控芯片上,可以基于上述原理实现磷酸盐待测样品和标准系列的同时显色,并利用手机摄像头对显色后的溶液进行拍照,再利用手机软件获取不同浓度磷酸盐显色后对应的RGB数据,根据公式

Y=R×0.299+G×0.587+
B×0.114

(1)

将RGB转化为Y(灰度)[13],最后通过建立灰度数据与浓度的标准曲线实现磷酸盐含量的分析.

3 实验部分

3.1 试剂或材料

氢氧化钠、酒石酸锑钾(A.R.,天津市大茂化学试剂厂),盐酸、硫酸(A.R.,成都市科龙化工试剂厂),无水乙醇(A.R.,成都市科隆化学品有限公司),丙酮(A.R.,天津化学试剂有限公司),乙二醇(A.R.,天津市百世化工有限公司),钼酸铵、抗坏血酸(A.R.,天津市光复科技发展有限公司),磷酸二氢钾(A.R.,广东光华科技股份有限公司),番红O(染料含量≥85%,Sigma-Aldrich),亮绿(染料含量≥85%,Koch-Light),实验用水为超纯水(娃哈哈纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司),所有的溶液使用前均经过0.45 μm微孔膜过滤.用于微流控芯片制作的PMMA板购自金亿有机玻璃制品厂.

磷储备溶液:准确称取0.0717 g干燥并恒重过的磷酸二氢钾溶于适量水中,然后用水定容至100 mL容量瓶中,得到500 mg/L(以磷酸根计)的磷储备液.

钼锑抗混合显色剂:称取0.13 g钼酸铵,0.0035 g酒石酸锑钾,溶于2 mL水中,缓缓加入1.2 mL硫酸,混匀,冷却后用水稀释至5 mL,得到26 g/L钼酸铵溶液.称取0.10 g抗坏血酸定容于1 mL水中,得到100 g/L抗坏血酸溶液.取0.2 mL 26 g/L钼酸铵溶液与0.1 mL 100 g/L抗坏血酸溶液混合后,用水稀释至1 mL即得到钼锑抗混合显色剂.

3.2 仪器和表征方法

鼓风恒温干燥箱(DHG-9070A,上海一恒科学仪器有限公司),超声波清洗器(KQ-100B,昆山市超声仪器有限公司),台式钻床(BG-5158),移液器、漩涡混合器(QL-901)(大龙兴创实验仪器股份公司),数显手机显微镜(上海韧跃电子科技有限公司),智能手机(Redmi Note 9 Pro).

3.3 实验步骤

微流控芯片的制作:撕去PMMA表面保护膜,依次用水、1 mmol/L盐酸、水、1 mmol/L氢氧化钠、水、乙醇在超声波清洗器中清洗5 min后,装入载玻片盒内于50 ℃烘干,以去除PMMA表面的污染物;用台钻在3 mm厚的PMMA板上打出直径5 mm的小孔作为储液池;在一个干净的玻璃片表面用200 μm铜丝调整好阳模形状,并用胶带在玻璃片背面固定,将上一步加工有储液池的PMMA板用长尾夹固定在有阳模的玻璃片和另一个干净玻璃片中间,于110 ℃在烘箱中热压15 min,冷却至室温后去除铜丝形成微通道;将加工有微通道的3 mm厚PMMA基片和另一个同样大小但厚度为1 mm的PMMA盖片在乙醇中清洗干净后,用长尾夹固定在一对干净的玻璃片之间,于95℃的烘箱中热封接10 min,冷却后用丙酮对芯片的外围进行密封.根据以上流程加工出图1所示的3种微流控芯片,并放于自封袋中备用.

图1 微流控芯片通道结构示意图

微流控芯片中溶液的混合:在十字型通道和Y型双螺旋通道中将两种染料混合,以证明双螺旋通道结构能够有效提高微通道中溶液的混合效率.为了避免染料在PMMA表面的吸附,微流控芯片使用前需用乙二醇充满通道并静置5 min,抽干储液池中的乙二醇后再注入染料[14].分别在十字型通道的A、B、C三池中分别加入乙二醇、10 mmol/L亮绿和10 mmol/L番红O各20 μL,3种溶液在液面压力差的作用下向D池流动,用数显手机显微镜记录混合通道中的现象.微通道中溶液混合现象记录装置如图2所示.然后在Y型双螺旋通道的A、B两池中加入10 mmol/L亮绿和10 mmol/L番红O各20 μL,用同样的方法记录两种溶液的混合现象,并与十字型通道中的实验结果进行对比.

图2 微通道中溶液混合现象记录装置

磷酸盐标准系列和待测样品在微流控集成芯片上的显色:分别取0,0.1,0.2,0.3,0.4 mL磷储备液于5个5 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,得到0,10,20,30,40 mg/L磷标准溶液.清洗Y型双螺旋集成芯片后先用乙二醇充满微通道并静置5 min,抽干储液池中的乙二醇.在集成芯片上每一个Y型结构的A、B两池中分别加入钼锑抗混合显色剂和磷酸盐溶液各40 μL.加溶液时使用移液枪先在6个B池中加入显色剂,然后于1 min内以浓度从小到大的顺序依次在6个A池中加入5个磷标准溶液和1个待测样品,由于集成芯片的对称结构和液面压力差的作用,磷酸盐溶液和显色剂会在双螺旋通道中混合并于6个C池中完成显色.

手机拍照、RGB值提取和数据处理:选用称量纸作为衬底,通过智能手机的摄像头对6个显色池在自然光下进行拍照,然后打开手机上的ColorMeter软件,点击图片取色→选择照片→选取C池中颜色均匀处→读取RGB值,图3为使用软件时的截图.根据不同浓度磷酸盐溶液的RGB值,得到对应的灰度值,建立灰度值与磷酸盐浓度的标准曲线,在该曲线上读取待测样品灰度值对应的磷酸盐浓度,完成磷酸盐含量的测定.

图3 ColorMeter软件RGB值提取界面

4 结果与讨论

4.1 PMMA微流控芯片的制作条件

实验中使用的金属丝热压法可以实现聚合物芯片的批量制作,成本低、易操作,图1中的3个芯片仅需2 h即可在一间普通化学实验室中完成加工,无需超净间和昂贵的设备.与报道的金属丝热压法中先压通道后打孔的流程不同[15],本实验在通道压制之前已将用作储液池的小孔用台钻加工完成,这样可以有效避免打孔时造成的通道末端变形和堵塞现象.PMMA的热变形温度是90 ℃,因此压制通道和封接温度需高于90 ℃,实验发现110 ℃下压制15 min的通道即可满足本实验中的混合要求,之后在95 ℃热封接10 min即可在保持通道结构的前提下实现基片和盖片的紧密贴合,温度过低会因封接不严导致漏液,温度过高会使通道变细甚至消失.图4是利用数显手机显微镜拍摄的通道放大照片.由图4可知,用这种方法制得的通道光滑均匀,保留了阳模中的细微结构.另外,数显手机显微镜的使用进一步降低了芯片制作成本,提高了实验装置的便携性,也增加了实验过程的趣味性.

(a)十字型通道 (b)Y型双螺旋通道图4 微流控芯片通道放大10倍后的显微镜照片

4.2 双螺旋型微通道的混合效果

尽管使用PMMA等聚合物材料可以降低芯片成本,但是大部分聚合物材料表面疏水,存在严重的非特异性吸附,会对微通道中流体流动行为产生影响.已有研究证明乙二醇可以有效抑制染料分子在聚合物表面的吸附[14],因此,本实验中的芯片使用前先用乙二醇充满通道并静置5 min,以完成通道表面的改性.如图5所示,经乙二醇改性后,十字型芯片中的亮绿和番红O在很长一段通道内几乎都不发生混合,上下流体界面清晰,仅在边界处能看到微小的扩散现象;而在双螺旋型通道内,两种染料流经不到0.5 cm的距离后即能够混合完全,混合速率可达到0.17 cm/s,由此证明双螺旋结构能够有效提高微通道中溶液的混合效率.

(a)十字型通道 (b)Y型双螺旋通道图5 两种染料在微通道中混合的显微镜照片

4.3 标准曲线的绘制和未知样的测定

按照GB/T 6913-2008方法中钼锑抗混合显色剂的用量,使不同浓度的磷酸盐溶液与显色剂在集成有6个双螺旋混合通道的芯片上进行混合和显色.双螺旋结构的存在可以在混合后30 s内即于C池显出蓝色,尽管此时样品和显色剂在双螺旋通道中已完成了充分混合,但是为了保证分析结果的准确性,需要等待储液池中有足够多的溶液再拍照,溶液过少会导致取色时产生较大的误差,因此最终选择混合2 min后再行拍照.周围光线在芯片表面的反射和斜射对照片中颜色提取造成的影响,可以通过用称量纸作为衬底拍照的方法有效避免[16].混合2 min后用智能手机拍摄以称量纸为衬底的显色照片如图6所示,其中个别周边储液池中显现的蓝色是由于液面压力差将显色剂压入磷酸盐溶液池中导致的.因此要特别注意显色过程中芯片中心废液池的液面,要及时抽去其中流入的废液,以防废液进入显色池对结果造成影响.

图6 微流控集成芯片上磷酸盐溶液的显色照片

用ColorMeter软件读取图片中的RGB值,并在Excel中通过公式(1)将RGB转化为灰度值,表1中列出了不同浓度的磷酸盐标准溶液与其对应的三原色值和灰度值,在磷酸盐浓度为0～40 mg/L的范围内得到线性拟合方程为Y= -1.6295X+ 164.05,其中X为浓度,mg/L,Y为灰度,相关系数为0.9972.将待测样品显色照片的灰度值113.182代入上述拟合方程中,得到相应的磷酸盐浓度为31.22 mg/L.

表1 不同浓度的磷酸盐标准溶液与其对应的RGB值和灰度值

4.4 方法精密度与对比实验

在同样的条件下对未知样品平行测定5次,得到该方法的相对标准偏差为2.9%.

将溶液体积等比例增大后,在相同实验条件下用可见分光光度计(722N,上海精密科学仪器有限公司)在波长710 nm处测得标准溶液的吸光度,得到线性拟合方程Y= 0.0018X- 0.0026,其中X为浓度,mg/L,Y为吸光度,相关系数为0.9918.将待测样品显色后溶液的吸光度值0.055带入上述拟合方程中,得到未知样中磷酸盐浓度为32.10 mg/L.与微流控-手机比色法相比,分光光度法得到的相关系数相差不大,二者测得未知样中磷含量的结果也基本相符.但从拟合方程的斜率来看,微流控-手机比色法的灵敏度比分光光度法要高.

5 结语

利用金属丝热压法在PMMA基材上加工了具有多个双螺旋型通道结构的微流控芯片,并将其用于不同浓度磷酸盐溶液与钼锑抗显色剂的混合与显色,配合智能手机比色分析法在显色后两分钟即可实现待测样品中磷酸盐含量的准确测定.微流控芯片和智能手机的配合使用缩短了传统磷钼蓝比色法的操作时间,提高了检测灵敏度,减少了危险试剂和大型仪器的使用,消除了由于显色程度随时间变化带来的误差,更能增强化学实验教学内容的前沿性和时代性.