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微波-超声辅助乳清分离蛋白糖基化工艺优化

2023-10-10林泽钳白卫东刘巧瑜曾晓房陈海光郭文山

中国调味品 2023年10期
关键词:拉德水浴糖基化

林泽钳,白卫东,刘巧瑜*,曾晓房,陈海光,郭文山

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院,广州 510225;2.仲恺农业工程学院广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室,农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室,广州 510225;3.仲恺农业工程学院 现代农业工程创新研究院,广州 510225)

乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)是动物乳中的一种优质蛋白质,奶酪制作工业的副产物。由于WPI是一种完全蛋白,且具有良好的功能特性(如乳化性、起泡性和凝胶性),被认为是蛋白类食品乳液递送体系的良好载体[1]。然而在食品工业中,环境因素如 pH、离子强度、温度等强烈影响了WPI的聚集行为,极大影响了WPI在工业加工中的应用。

蛋白分子的修饰改性被认为是一种能有效改善蛋白功能特性的方法[2]。在过去的研究中,糖基化改性蛋白具有更宽的pH稳定性[3]、更强的离子稳定性[4]和更好的热稳定性[5]。糖基化反应主要分为干法和湿法,其中干法条件严格、成本高、反应缓慢且难控制,不适合工业应用[6];而湿法操作简单、反应时间短、产品性能更稳定[7]。但在湿美拉德反应中,蛋白质容易发生变性和聚集,降低了其与糖的共价结合能力,导致产物的接枝度、利用效率低[8]。此外,长时间的高温也促进了副反应的发生,可能形成抗营养物质和有毒物质[9]。因此,前人对湿美拉德法糖基化工艺进行了改进,以增加糖基化效率和减少副反应的发生。He等[10]首创了一种高/低温循环的湿美拉德法,制得了高接枝度、低褐变度的糖基化蛋白;管军军等[11]发现了微波辐射加热对大豆分离蛋白-接枝多糖的反应速率比水浴加热提高了60 倍,显著减少了产物中自由氨基、类黑素、DG等小分子物质的生成;宋旸等[12]采用微波作为预处理,Jin等[13]利用超声作为预处理分别缩短了蛋白-多糖接枝反应时间,提高了蛋白的接枝度和乳化性能。

微波-超声联用作为一种新型的蛋白改性方法,其中微波辐射引起极性分子高速运动,使大分子氢键断裂,辅以超声剪切力、空化作用等提高改性速率,可将蛋白结构展开,使内部疏水基团暴露,增加反应结合位点。但微波-超声联用技术目前主要应用在目标物萃取及物质合成方面[14-16],而在物理改性方面的应用研究较少。因此,该实验将通过微波-超声联用辅助糖基化WPI,研究不同的微波-超声次数、WPI∶GOS(质量比)、水浴温度、水浴时间对WPI-GOS的接枝度、乳化活性和乳化稳定性的影响。并以接枝度为响应值,通过响应面法对WPI-GOS的微波-超声波复合物理场辅助糖基化反应工艺进行优化,旨在研究一种高接枝度、低褐变度的湿美拉德反应蛋白糖基化方法,为后期WPI的综合开发与利用提供一种新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乳清分离蛋白、低聚半乳糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化钾、OPA、四硼酸钠、DDT、3 500 Da透析袋:上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

F60 高速均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司;超声微波协同工作站 南京先欧仪器制造有限公司;UV-1780紫外可见分光光度计、RF-6000 荧光光谱仪、IRAffinity-1 傅里叶红外光谱仪 岛津仪器(苏州)有限公司;JY600C电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司;Nano-ZS型动态光散射仪 英国Malvern 公司。

1.3 方法

1.3.1 接枝度测定

根据Pirestani等[17]的方法,配制 OPA溶液(0.64% OPA、0.78% DDT、0.8% SDS、3.048% Na2B4O7)。400 μL 0.1 mg/mL蛋白溶液与3 mL OPA溶液反应2 min,测定吸光值。按式(1)计算接枝度:

(1)

式中:DG表示接枝度,%;A0表示空白组的吸光度;A1表示对照组的吸光度;A2表示实验组的吸光度。

1.3.2 乳化活性和乳化稳定性的测定

参照吴爽等[18]的方法,配制2 mg/mL蛋白溶液,与大豆油按3∶1(体积比)混合,10 000 r/min条件下均质1 min,分别在0 min 和静置10 min从样品底部取出50 μL 乳液加入5 mL 0.1%的SDS 溶液中,振匀后测定其在500 nm 处的吸光度A0和A10。按式(2)和式(3)分别计算乳浊液的乳化活性指数EAI和乳化稳定性指数(ESI):

(2)

(3)

式中:EAI表示乳化活性指数,g/m2;ESI表示乳化稳定性指数,min;N表示稀释倍数;ρ表示蛋白浓度,mg/mL;φ表示油相体积分数,%;A0表示0 min反应溶液的吸光度;A10表示10 min反应溶液的吸光度。

1.3.3 单因素实验设计

图1 微波-超声预处理WPI-GOS接枝反应实验流程简图

将6.00 g WPI溶于0.1 mol/L pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,加入一定质量比例的GOS,磁力搅拌30 min充分水合。设置微波-超声协同工作站设备,微波功率为300 W,超声功率为300 W,最高温度为80 ℃。将WPI-GOS混合溶液冰浴至20 ℃,微波-超声至温度达到80 ℃时,记为一次循环,按需求重复上述操作,最后水浴搅拌加热,冷却至室温,冻干待用。单因素实验设计见表1。

表 1 单因素实验设计因素水平

1.3.4 响应面实验设计

根据单因素实验结果,选择WPI∶GOS(质量比)、水浴温度、水浴时间为自变量,以蛋白接枝度为响应值,运用Design-Expert 12.0 软件进行三因素三水平实验设计,响应面实验设计见表2。

表 2 响应面实验因素水平表

1.3.5 傅里叶红外光谱

根据Li等[8]的方法,采用溴化钾压片法,蛋白与溴化钾的质量比为1∶200,光谱分辨率为4 cm-1,扫描32次,扫描范围为4 000~400 cm-1。

1.3.6 粒径测定

将10 mg/mL蛋白溶液与大豆油按体积比9∶1混匀,665 W超声乳化1 min,制得乳液。以超纯水中稀释100倍,测量其在不同pH和温度条件下的粒径分布情况以及多分散系数(PDI)。

1.3.7 反应程度与色泽的分析

用超纯水稀释蛋白样品至2.5 mg/mL,采用紫外可见分光光度计测定A420 nm,表示产物的褐变程度;用超纯水稀释蛋白样品至1 mg/mL测定A294 nm,表示美拉德反应的中间产物。称取适量样品于透明密封袋中,测量蛋白的L*、a*和b*值。根据下式计算样品的白度值(W)与色差值(ΔE):

(5)

(6)

1.3.8 结果分析

采用 Origin 2020 和 Excel 2010 绘制单因素实验结果图,采用SPSS 2020对单因素数据进行方差统计分析(P<0.05表示差异有显著的统计学意义),采用Design-Expert 8.0 软件对响应面实验结果进行分析,所有数据均为3次重复实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 微波-超声次数对WPI糖基化产物的影响

(a)

由图2可知,随着微波-超声次数的增加,WPI的接枝度、乳化活性和乳化稳定性均呈现先上升后下降的趋势,微波-超声次数为3次时达到最大值,分别为60.12%、330.42 m2/g和39.58 min。微波-超声波协同处理WPI-GOS过程中,微波作用使极性分子高速运动,辅以超声波的空化效应和机械作用,可使分子中的氢键、离子键等断裂,使WPI分子结构发生变化,致密、有序的分子结构变得松散、无序,更多适宜的结合位点暴露,促进了糖基化反应的进行。随着微波-超声到一定次数后,WPI不再有适宜与GOS结合的位点暴露,糖基化反应也达到饱和。此时,反应体系内分子的部分化学键继续断裂,且可能生成高度活跃的自由基,引发一系列的副反应,使产物的乳化活性和乳化稳定性下降。

2.2 WPI∶GOS(质量比)对WPI糖基化产物的影响

由图3可知,随着WPI与GOS质量比的增加,WPI的接枝度、乳化活性和乳化稳定性先陡升后缓降,在WPI与GOS质量比为3∶1时,达到最大值。单位空间内GOS数量增多,WPI与GOS分子接触和反应的概率增加。GOS接枝到WPI上后,一方面,WPI两亲性增强,接枝物更加紧密地吸附在油-水界面上,形成致密的界面膜,从而提高了WPI的乳化活性;另一方面,亲水性的GOS在外层,提供了一定的空间位阻,阻止了界面蛋白的聚合,增强了WPI的乳化稳定性[18]。但随着单位空间内GOS分子继续增加,美拉德反应从初级反应继续向中级反应甚至高级反应推进。此时,蛋白结构趋于紊乱且副产物增多,乳化活性和乳化稳定性也随之下降。

(a)

2.3 水浴温度对WPI糖基化产物的影响

由图4可知,微波-超声处理使WPI结构展开,暴露更多结合位点,但此过程的糖基化反应并不完全[19],故需继续加热反应。随着水浴温度的增加, WPI的接枝度、乳化活性、乳化稳定性都呈先上升后下降的趋势,在60 ℃时均达到最大值。He等[10]认为,糖基化反应是美拉德反应的伪零级反应,通过温度可以控制美拉德反应的初级阶段,减少糖基化过程中副反应的发生。适宜的温度为反应体系提供了适量的活化能,促进了基化反应的发生。在进一步升温中,分子中过多的活化能触发了下一个反应的发生,使WPI-GOS减少,反应产物的接枝度、乳化活性、乳化稳定性随之下降。此外,高温使WPI分子结构充分展开,蛋白分子由于疏水相互作用聚集,阻碍了糖基化反应的进行。

2.4 水浴时间对WPI糖基化产物的影响

由图5可知,随着水浴时间的增加,WPI的接枝度、乳化活性、乳化稳定性都呈先上升后下降的趋势,其中WPI的乳化活性和乳化稳定性在60 min时达到最大值。美拉德反应前期,WPI与GOS受热后逐步结合。在进一步加热后,WPI蛋白结构充分延展,且WPI中的部分赖氨酸被破坏[18],蛋白分子之间的相互作用增强,导致蛋白质凝聚,接枝度下降,这与陈又铭等[20]的实验结果相似。此外,蛋白结构充分展开,WPI与过多的GOS结合,会导致WPI-GOS趋于亲水性,乳化活性和乳化稳定性下降。

(a)

2.5 响应面分析

2.5.1 响应面模型建立及回归方差分析

综合分析单因素实验结果后,WPI∶GOS(质量比)选取2∶1、3∶1、4∶1,水浴温度选取50,60,70 ℃,水浴时间选取50,60,70 min,以接枝度为响应值,采用Box-Behnken 法进行实验因素设计,实验方案及结果见表3。

表3 Box-Behnken 响应面实验设计与结果

运用Design-Expert 12.0 对各因素进行二次多元回归拟合,得到二次回归方程:接枝度(%)=62.81+2.71A+3.11B+1.83C-3.05AB-1.03AC+1.7BC-3.02A2-7.63B2-8.07C2。

以接枝度为响应值的二次多项回归方程模型中(见表4),模型的P<0.000 1,表明该预测模型极显著;失拟项的P=0.069>0.05,表明失拟项差异不显著;相关系数R2=0.999 6,校正决定系数RAdj2=0.998 7,变异系数(C.V.)为0.12%,拟合度和可信度高,表明此模型可以很好地反映WPI-GOS接枝度与WPI∶GOS、水浴温度和水浴时间各因素之间的关系,能较好地描述该微波-超声预处理的后续工艺对WPI-GOS接枝度影响的情况。一次项、二次项和交互项对其影响均极显著。由F值可知,各因素对WPI-GOS接枝度的影响程度为B>A>C。

表4 接枝度回归模型方差分析

2.5.2 响应面各因素间交互作用分析

由图6可知,随着WPI∶GOS(质量比)、水浴温度和水浴时间3个因素的增大,WPI-GOS接枝度呈现先上升后下降的趋势,与单因素实验结果一致,在设定的自变量范围内均存在响应曲面最高点,说明因素之间的影响显著。当其他因素恒定时,在一定的范围内,随着WPI∶GOS (质量比)的增加,WPI-GOS接枝度增加幅度最大,曲线相对较陡,水浴温度和水浴时间的影响次之。WPI∶GOS (质量比)与水浴温度和水浴时间的等高线椭圆效果明显,表明WPI∶GOS (质量比)与水浴温度和水浴时间的交互作用对WPI-GOS接枝度的影响较大。

2.5.3 优化工艺的确定和验证实验

运用Design-Expert 12.0 软件对实验结果进行分析优化(见表5),得出理论最优工艺条件为WPI∶GOS (质量比)2.78∶1、水浴温度61.29 ℃、水浴时间61.59 min,由此预测出WPI-GOS接枝度为62.53%。根据实际可操作性,将其修正为WPI∶GOS (质量比)2.8∶1、水浴温度61.3 ℃、水浴时间61.7 min。在修正的优化条件下进行验证实验,进行3 次平行实验,取平均值后得到的接枝度为(62.48±0.74)%,与预测值比较接近,表明响应面法对微波-超声预处理WPI-GOS接枝工艺条件进行优化是稳定可行的,对实践具有一定指导意义。

表5 优化实验结果

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

图7 微波-超声辅助糖基化改性WPI 的红外光谱图

2.7 纳米粒径

由图8可知WPI、WPI+GOS混合物和WPI-GOS缀合物乳液在不同pH值和温度下的粒径变化情况。pH值和温度都会影响WPI电离和乳化的程度,从而改变乳液的稳定性。相对于WPI和WPI+GOS混合物乳液,在整个pH和温度范围内,WPI-GOS缀合物的粒径和PDI更小,且在等电点pIWPI=5附近乳液粒径的增大幅度较小。表明WPI-GOS缀合物乳液是稳定的,可防止乳滴在pIWPI附近和高温下的聚集。这可能是亲水性GOS附着在乳滴外层,提供了一定的空间位阻,一方面克服了乳滴之间的静电引力和范德华力作用[21],抑制了乳滴的聚集;另一方面,空间位阻也削弱了肽链的热吸收,从而减少了热处理对蛋白质结构造成的损害。

(a)

图9 WPI及WPI-GOS接枝物反应体系A294 nm、A420 nm、白度及色差变化

2.8 反应程度与色泽的分析

A290 nm常用来测定美拉德反应中间产物的含量,而A420 nm则被用于测定最终产物。WPI与GOS的接枝反应会发生颜色的褐变,其褐变与美拉德反应进行的程度呈正相关。WPI在糖基化后A290 nm大幅增加,而A420 nm小幅增加,说明体系发生了美拉德反应。WPI的ε-NH2与GOS的-CHO脱水缩合,生成了中间产物。虽然部分中间产物继续进行美拉德反应,但由于体系温度较低,使蛋白的褐变程度较慢,所以接枝产物和WPI在白度和色差上差异性较小。

3 总结

该研究主要解决了湿法糖基化蛋白改性接枝度低、褐变程度高的难题,显著提高了改性蛋白的pH稳定性和热稳定性。微波-超声辅助分离乳清蛋白糖基化的优化结果:微波-超声3次、WPI∶GOS (质量比)2.8∶1、水浴温度61.3 ℃、水浴时间61.7 min,该工艺下WPI的接枝度为(62.48±0.74)%。该工艺下,GOS对WPI结构修饰作用明显,乳化性能显著提高,制得的WPI-GOS缀合物乳液具有优良的pH稳定性和热稳定性,产物褐变程度低、白度高,表明该工艺可以很好地控制糖基化过程中美拉德反应初级反应和中级反应的速率,更好地控制糖基化产物的产出。为WPI-GOS缀合物成为食品中挥发油、香料和生物活性化合物等的包封剂的生产提供了一种新的方法。如Doi等[22]通过模拟烹饪过程中乳液中大蒜显微的释放,发现WPI乳液粒径小但热稳定性差是导致乳滴中风味物质在烹饪过程中损失的主要原因。此外,美拉德反应也为改性蛋白提供了一定的风味成分。但该方法也面临着一些问题,如生产工艺和产物分离多糖的成本高、多糖的利用效率低等,限制了该工艺的应用。还需要进一步优化工艺,如采用换热器降低能量功耗、超滤多糖浓缩重复利用等,以降低成本、接近生产实际。

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