固态食醋自然发酵醋醅中生淀粉酶产生菌的筛选及初步应用

康雪梅,罗雯,郭建,孙群

(1.四川大学 生命科学学院,成都 610064;2.千禾味业食品股份有限公司,四川 眉山 625000)

中国传统谷物醋是以生谷物为原料,大曲等为发酵剂,在开放式环境中发酵而成,其中涉及多菌种及多酶系的相互作用,多菌种混合发酵赋予谷物醋丰富且协调的风味与口感[1-4]。固态食醋发酵过程中,微生物菌群的代谢网络表明曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、红曲(Monascus)是食醋大曲中主要的真菌,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和汉逊酵母(Hansenulaanomala)是酒精发酵阶段的主要酵母菌,醋酸菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacer)和芽孢杆菌属(Bacillus)是食醋风味物质产生的核心功能菌群,在醋的优势风味物质形成中起着重要作用[5-7]。

选育获取优良性能的功能微生物并进行强化生产,可促进食醋发酵生产提高生产效率,降低成本,改善品质。在食醋醋醅中添加A.pasteurianusG3-2、L.brevis4-22、L.fermentumM10-3和L.buchneriF2-5,可以原位增强食醋菌群的产乙偶姻功能[6]。在醋酸发酵开始时添加内源巴氏杆菌,可以增强镇江香醋的风味,缩短了醋酸发酵周期,提高了总酸、2,3-丁二醇和川芎嗪的积累[8]。在保宁醋生产中,使用黑曲霉进行强化制曲,可使原料利用率及有机酸含量得到提高[9-10]。将食醋醋醅中非常丰富的物种KomagataeibactereuropaeusJNP1筛选出来并强化应用到食醋发酵中,可使食醋总酸提升14.78%,还原糖降低40.38%,促进食醋出醋率的提升[11]。

本文从自然发酵醋醅中筛选获取同时产生淀粉酶及蛋白酶的菌株,验证其在酸性条件下的生长性能及酶活性能,并将其初步强化应用到食醋发酵过程中,为固态食醋发酵生产的降本增效及风味改善提供了新的改善思路。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

千禾味业食品股份有限公司食醋生产车间发酵周期为1～24 d的自然发酵状态下的固态醋醋醅样品共24个,用无菌采样袋采样后存放于4 ℃冰箱中备用。

18种氨基酸标品(均为色谱纯):购自Sigma公司;7种有机酸标品(均为色谱纯):购自J &K公司、Aladdin等试剂官网;其他化学试剂:均为分析纯。

1.2 培养基

富集培养基:可溶性淀粉20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,Na2HPO40.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,溶剂为蒸馏水。

初筛培养基:富集培养基内添加琼脂20 g/L。

复筛培养基:生玉米淀粉20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,Na2HPO40.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,琼脂20 g/L,溶剂为蒸馏水,其中生玉米淀粉单独称取到称量瓶中,107 ℃烘箱干热灭菌2 h后,在使用前加入到灭菌后的培养基中,混匀后倾倒平板。

酱油培养基:酱油原油50 g/L(氨基酸态氮大于1.2 g/dL),葡萄糖 20 g/L,溶剂为蒸馏水。

1.3 实验方法

1.3.1 生淀粉酶产生菌筛选

称取100 g醋醅样品于1 000 mL 0.85%的生理盐水中混合均匀并过滤得到清液,取1 mL至富集培养基中,30 ℃、150 r/min培养2～3 d,并进行3轮连续富集培养。将富集完成的菌液梯度稀释后涂布于初筛培养基平板,35 ℃培养12～48 h后,挑选具有明显水解透明圈生成的菌落,得到淀粉酶产生菌,进行保存。同时点种至复筛培养基平板,35 ℃培养12～48 h后,挑选透明圈直径与菌落直径比较大的菌落进行保存,得到生淀粉酶产生菌。

1.3.2 酶活力测定

待测菌株使用LB液体培养基活化培养48 h后,10 000 r/min、4 ℃离心10 min所得上清液即为粗酶液。

淀粉酶(或生淀粉酶)酶活定义:在40 ℃条件下,以可溶性淀粉(或玉米生淀粉)为底物,以醋酸-醋酸钠(50 mmol/L,pH 5.8)为缓冲液,每1 min释放1 mg还原糖(以葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位,记为1 U。测定方法:取5 mL底物溶液(可溶性淀粉或玉米淀粉)于试管内,在40 ℃下保温5 min,加入40 ℃保温5 min的酶液 30 μL,200 r/min反应30 min,用200 μL 200 mmol/L的NaOH终止反应,以200 r/min反应5 min,得反应液。对照反应添加灭活后酶液进行相同处理。用DNS法测定反应液与对照反应液中的葡萄糖生成量,计算相应的酶活。

pH对酶活的影响测定方法:使相同浓度底物溶液溶解于不同pH的缓冲溶液中(50 mmol/L),测定并计算酶活,其中缓冲溶液为不同pH条件下的NaH2PO4-Na2HPO4(50 mmol/L)缓冲液或醋酸-醋酸钠(50 mmol/L)缓冲液。

采用GB/T 23527—2009中福林-酚法测定中性蛋白酶及酸性蛋白酶酶活。

1.3.3 目标菌株鉴定

以目标菌株的总DNA为模板,利用引物P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和P2:5′-AAG-GAG

GTGATCCAGCCGCA-3′扩增菌株的16S rDNA基因,委托生工生物工程(上海)股份有限公司对该菌的16S rDNA扩增及测序,得到该菌株的16S rDNA序列后,在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列,并进行同源性比对,构建进化树,确定其种属。

1.3.4 菌株培养及耐酸性实验

菌株培养:使用食品级LB(酵母粉 5 g/L,蛋白胨 10 g/L,NaCl 10 g/L)培养基进行种子培养及菌株生长耐酸性能验证。使用酱油培养基进行菌株的扩大培养,得到发酵菌株培养液,用于发酵生产。

耐酸性实验:配制LB培养基(pH 6.0～3.0,乳酸调节),灭菌后接种种子液在35 ℃、200 r/min进行培养,观察菌株的生长状况。

1.3.5 菌株产乙偶姻功能验证

LB液体培养基进行液态培养48 h得到的菌株培养液,以10 000 r/min离心,分离得到上清液备用。以未接种菌株的空白培养基作为对照,采用肌酐比色法测定乙偶姻含量[6]。

3）喷嘴烟气流速：再循环烟气在炉内需起到充分搅拌及降低炉温的作用，不同炉型、不同处理规模的焚烧炉对应的最低风速要求均不相同。喷嘴烟气流速需根据炉膛流场模拟进行设计，并结合运行情况进行优化。

1.3.6 目标菌株在固态食醋酿造中的初步应用

将目标菌株用LB斜面培养后,于酱油培养基中进行种子培养,获得发酵菌种,并进一步转接至酱油培养基进行扩大培养,获得发酵培养液。将获得的发酵培养液按0.25%的接种量接种至液化糖醪液中,静置培养过夜后,下水拌醅进行食醋发酵,每轮选择车间3个楼层共6个发酵池作为实验组,对照组为分别与实验组同楼层的未接种目标菌株的正常进行下水发酵生产的食醋。发酵过程中检测总酸、氨氮的生成情况,发酵结束后进行淋醋,所得原醋进行总酸、氨氮、有机酸、氨基酸及风味物质检测。连续进行3轮实验后,计算出醋率。

1.4 分析方法及数据处理

实验结果均为3次实验的平均值,使用GraphPad Prism 9进行数据统计分析及绘图,P<0.05表示显著差异。

食醋总酸、氨氮、有机酸、氨基酸、风味物质等的测定参照文献[9,12]的方法。

2 结果与分析

2.1 生淀粉酶产生菌的筛选

2.1.1 生淀粉酶产生菌株的筛选

采用透明圈法筛选出透明圈直径与菌落直径比大于2.5的菌株共78株,即为产淀粉酶菌株。为满足食醋生料发酵需要,进一步复筛得到具有透明圈且透明圈直径与菌落直径比大于2的菌株共16株,进行进一步的分离纯化,获得生淀粉酶产生菌,见图1。

图1 生淀粉酶产生菌

2.1.2 生淀粉酶产生菌酶活测定及目标菌株的确定

复筛所得生淀粉酶产生菌通过16S rDNA序列对比分析进行鉴定,结果见表1,编号为k4、k5、k6、k7、k13的菌株鉴定为巴氏醋杆菌巴氏亚种(A.pasteurianussubsp.pasteurianus),通过酶活测定,菌株均有淀粉酶、生淀粉酶及中性蛋白酶活性,除k4及k13具有较低的酸性蛋白酶活性外,其他几株巴氏醋杆菌均无酸性蛋白酶活性。在固态食醋发酵中,巴氏醋杆菌为产酸主要功能性菌株,其同时具有产生淀粉酶活性及蛋白酶活性,将在一定程度上促进原料淀粉、蛋白的分解利用。筛选获取的菌株除巴氏醋杆菌外,其他鉴定结果显示均为芽孢杆菌属(Bacillus),包括死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)、枯草芽孢杆菌堆肥亚种(B.subtilissubsp.stercoris)、中村芽孢杆菌(B.nakamurai),酶活测定结果显示其均具有较好的生淀粉酶、淀粉酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶活性。

表1 菌株产酶酶活测定

芽孢杆菌抗逆性强,部分对乙酸、高温具有耐受性,同时也被认为是一种食品级的安全菌株,具有丰富的酶系,能参与多种催化反应,具有较高的商业价值。筛选所得菌株在不同pH条件下培养的结果见表2。k4、k5、k6、k7、k13均能在酸性条件下生长,并且在pH 3.0时均能生长,接种液体培养基12 h内均可形成浑浊菌液。所有芽孢杆菌在pH 4.5条件下均能生长,在pH 4.0时,k2、k12、k15能生长,但是在接种后培养36 h内不能形成浑浊菌液,在pH 3.5时,k3、k8均不能在36 h内形成浑浊菌液,在pH 3.5及pH 3.0时,k1、k9、k16、k11均能正常生长,且能在接种培养36 h 内形成明显的浑浊菌液。由此可知,在食醋发酵过程中,在低pH环境条件下,死谷芽孢杆菌k1、暹罗芽孢杆菌k9、k16、中村芽孢杆菌k11的生长不会受到影响,为食醋发酵中的又一种可利用的功能菌株。结合表1的酶活测定结果,由于暹罗芽孢杆菌k9缺少酸性蛋白酶酶活,死谷芽孢杆菌k1、暹罗芽孢杆菌k16、中村芽孢杆菌k11可作为优势菌株进行进一步研究及利用。

表2 pH对菌株生长的影响

2.1.3 pH对目标菌株产酶酶活的影响

考察在酸性条件下菌株产酶酶活的变化情况,进一步评估目标菌株在食醋发酵过程中的适用性。由图2可知,k1、k16、k11所产生的生淀粉酶最佳pH分别为6.5,7.0,6.5。在碱性条件下,酶活随着pH的升高而升高,在酸性条件下,酶活随着pH的降低而降低,在pH 3.0时,菌株残余酶活为最佳酶活的50%以上,其中,中村芽孢杆菌k11所产生的生淀粉酶酶活为最佳酶活的81.15%,保留了最大的酶活。死谷芽孢杆菌k1、暹罗芽孢杆菌k16的残余酶活分别为初始酶活的52.84%及65.95%。中村芽孢杆菌k11为食醋发酵生产中的最佳生淀粉酶产生菌,可作为目标菌株进行在食醋生产中的应用实验。

图2 pH对酶活的影响

2.1.4 目标菌株产乙偶姻功能验证

乙偶姻是食醋中一种重要的风味物质,能够提供浓郁的奶油香,赋予食醋香甜美味。同时,乙偶姻也是功能性物质四甲基吡嗪的重要前体物质[13-15]。

由图3可知,筛选获取菌株均具有产乙偶姻功能,其中,菌株k5、k7、k13所产乙偶姻均明显低于其他菌株,分子生物学鉴定显示其均为巴氏醋杆菌,研究表明巴氏醋杆菌具有乙偶姻生成功能,但将其与乳酸菌进行共培养,乙偶姻的积累更明显[6]。同时,芽孢杆菌也可促进食醋中乙偶姻的积累,如在保宁醋发酵过程中使用强化接种解淀粉芽孢杆菌的大曲,将使发酵所得食醋乙偶姻含量大幅提升[16]。所筛选菌株中,k11、k14、k15的乙偶姻含量均较高,分别为45.71,45.21,45.38 mg/L,可作为产乙偶姻功能性菌株进一步应用到固态食醋发酵过程中。结合筛选菌株在酸性条件的生长情况及其所产生淀粉酶在pH 3.0～4.0之间的酶活情况,综合考虑,选取中村芽孢杆菌k11作为目标菌株进行固态食醋发酵的应用。

图3 菌株产乙偶姻浓度测定

2.2 生淀粉酶产生菌在固态食醋发酵过程中的初步应用

2.2.1 发酵过程中理化指标随发酵周期的变化情况

测定了发酵过程中发酵池底卤汁的理化指标,结果见图4。

图4 总酸、不挥发酸、氨氮、酒精度、还原糖、发酵温度随发酵周期的变化

实验组与对照组在发酵过程中,总酸含量不断升高,实验组在发酵过程中总酸、氨氮等均高于对照组,且实验组总酸的升高速度快于对照组,可见k11产生的淀粉酶、蛋白酶等对原料中淀粉、蛋白的水解促进了还原糖即氨基酸的生成,促使酒精发酵、醋酸发酵更快速地进行,促进总酸的生成,氨基酸的生成使氨氮的含量升高。发酵结束时实验组的卤汁总酸为(7.10±0.14) g/dL,对照组为(6.28±0.25) g/dL,提高了15.9%。发酵结束时发酵池卤汁中氨氮含量明显高于对照组,实验组为(0.65±0.01) g/dL,对照组为(0.592±0.01) g/dL。食醋发酵过程中整体不挥发酸含量均先升高后降低,在发酵开始到接近发酵中期,卤汁中不挥发酸浓度逐渐升高,在发酵第10～12天,不挥发酸达到最高值,随着发酵进行,不挥发酸开始逐渐降低,但实验组整体不挥发酸浓度均高于实验组。

发酵开始到发酵周期第4天,实验组与对照组卤汁中酒精度均表现出明显且迅速地增高,第4天之后,酒精度逐渐降低,发酵后期,酒精度缓慢下降,到发酵后期,实验组与对照组卤汁中酒精度均低于0.5 %。发酵过程为淀粉糖化、酒精发酵、醋酸发酵同时进行,在发酵前期,淀粉糖化与酒精发酵速度高于醋酸发酵速度,酒精含量总体呈升高趋势,随着醋酸菌的生长与代谢逐渐旺盛,酒精产生的速度在一定程度上降低,同时酒精被快速消耗,醋酸快速生成,随着发酵周期的进行,淀粉糖化、酒精发酵与醋酸发酵均在一定程度上进行,保持着一种微妙的平衡关系,直至发酵结束,酒精含量降低,醋酸含量达到最大值。在发酵过程中,酶解糖化淀粉质所提供的还原糖为酒精发酵及醋酸发酵所需的底物,同时也为其他微生物菌群提供了能源,因此在整个发酵过程中,无还原糖的累积阶段,还原糖一直处在生成与被消耗利用的过程中。随着发酵的进行,酸度升高,pH降低,长期的酸性环境使大部分不耐酸的微生物死亡,仅留下耐酸高渗微生物存在于发酵后期。随着发酵的进行,在发酵前期,酵母产酒及醋酸菌等其他微生物的生长代谢,使发酵醋醅中温度急剧升高,通过翻醅等手段可在发酵前期将醋醅温度控制在42 ℃以下,防止烧醅,保证发酵的正常进行,发酵中后期,随着酸度升高,微生物代谢减弱,发酵醋醅温度也逐渐降低,在发酵中后期维持在32～34 ℃较稳定的温度范围内。

2.2.2 强化菌株对食醋出醋率的影响

连续进行3轮中村芽孢杆菌k11的强化实验,每轮6个不同楼层的发酵池为实验组,分别与实验组同楼层同日下水制醅的6个不接种中村芽孢杆菌k11的发酵池为对照组,每2个发酵池套淋得到一批原醋,每轮3批醋高温灭菌后放置于同一个储存罐内。3次强化实验的出醋率数据见图5。中村芽孢杆菌k11强化组3次实验的出醋率分别为(58.50±0.63)%、(58.08±0.55)%、(58.19±0.21)%,对照组的出醋率分别为(55.50±0.06)%、(55.29±0.13)%及(53.69±1.35)%,中村芽孢杆菌k11强化实验组3次实验结束后通过套淋所得食醋折标(3.5 g/dL)分别为(43.92±0.45),(43.60±0.71),(43.69±0.49) kL,对照组3次实验结束后通过套淋所得食醋折标产量分别为(41.66±0.39),(41.50±0.39),(40.31±2.26) kL,实验组3次实验比对照组分别增加了2.26,2.10,3.38 kL食醋,对应出醋率分别提高了5.4%、5.05%及8.40%,具有显著效果。中村芽孢杆菌k11具有产生淀粉酶的能力,能在酸性条件下生长且产酶,所产生淀粉酶在酸性条下能保持较好的酶活,在食醋发酵生产中,发酵开始时强化接种中村芽孢杆菌k11,在淀粉质原料所组成的醋醅环境中,优于淀粉、蛋白质等的存在,促进中村芽孢杆菌进一步生长繁殖并产生生淀粉酶、蛋白酶等,作用于原料淀粉及蛋白质,促进淀粉、蛋白质的分解,同时生成的还原糖及氨基酸等又进一步作为碳源、氮源促进微生物细胞的生长繁殖,促进淀粉糖化、酒精发酵、醋酸发酵的进一步进行,提高最终的出醋率,使原料的利用率进一步提高。

图5 3轮实验出醋率分析

2.2.3 食醋有机酸、氨基酸含量分析

3次实验分别淋取得到3批实验组原醋,对应酸度分别为(6.67±0.23),(6.23±0.45),(6.44±0.28) g/dL,各22 kL,3批对照组原醋酸度分别为(6.66±0.43),(6.18±0.53),(6.35±0.53) g/dL,各22 kL。取第1次实验对应的实验组与对照组原醋,分别测定其中有机酸与氨基酸组成与含量,所得结果见图6。

图6 食醋中有机酸(a)、氨基酸(b)组成及含量分析

由图6中a可知,中村芽孢杆菌k11强化实验组乳酸含量明显高于对照组,乙酸含量明显低于对照组,且实验组检测出了苹果酸,对照组未检出苹果酸,实验组中草酸含量明显低于对照组,其他有机酸含量基本保持不变。乳酸、苹果酸等不挥发酸占比升高,能够降低食醋的刺激味,使食醋的口感更柔和[2,17]。由图6中b可知,实验组总氨基酸含量明显高于对照组,其中,天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸在总氨基酸中的占比基本保持不变,强化接入中村芽孢杆菌k11后,谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸含量明显降低,赖氨酸含量明显升高,对照组未检出半胱氨酸,但强化中村芽孢杆菌实验组半胱氨酸含量为(214 9±5.76) mg/L,占总氨基酸含量的9.51%。可见中村芽孢杆菌强化接入醋醅后,中村芽孢杆菌所产蛋白酶作用于原料大米、麸皮等,促进了原料中蛋白质分解,中村芽孢杆菌蛋白酶中有作用于半胱氨酸与其他氨基酸所形成的肽键基团,使肽键水解,释放出半胱氨酸,同时,与如谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的相应肽键的亲和力不如醋醅中其他微生物所释放的蛋白酶,从而使食醋中谷氨酸、丙氨酸等氨基酸在总游离氨基酸中的占比降低[18]。

2.2.4 食醋风味物质的比较分析

取第一次实验对应的实验组与对照组原醋,使用GC-MS进行风味物质扫描分析,所得结果分别按风味物质类别进行统计分析,结果见图7。

图7 食醋中风味物质组成分析

由图7可知,中村芽孢杆菌k11强化组风味物质的总峰面积远高于对照组,其中,酯类、醇类、酮类、酚类含量明显增高,酸类含量比对照组偏低。由于中村芽孢杆菌具有产乙偶姻功能,且乙偶姻为食醋中较重要的酮类物质,因此,酮类明显增加,又因在微生物代谢中,乙偶姻可以与2,3-丁二醇相互转化,同时也与双乙酰含量相关,因此,酮类物质、醇类物质总含量均高于对照组[19-20]。由于乙偶姻是四甲基吡嗪的重要前体物质,因此,在中村芽孢杆菌k11强化组中吡嗪类物质显著高于对照组。将中村芽孢杆菌k11应用到固态食醋酿造过程中,对丰富食醋风味物质具有积极作用。

3 结论

本研究从自然发酵醋醅中筛选获得生淀粉酶、蛋白酶产生菌,鉴定为中村芽孢杆菌,编号为k11,此菌株能在酸性条件下生长并产酶,所产生淀粉酶在酸性条件下能保存80%以上的酶活,并具有高产乙偶姻功能。将此菌株在固态食醋发酵生产中进行初步应用,在发酵过程中,池底卤汁的总酸、氨氮、不挥发酸含量等均有明显提高,通过3轮重复应用实验,可使食醋出醋率分别提高5.40%、5.05%及8.40%,可在一定程度上降低生产成本。所得食醋乳酸、苹果酸占比提升,草酸含量降低,可使食醋的口感柔和。游离氨基酸总量提升了71.52%,且增加了其中半胱氨酸的含量,增加了食醋的酸味,且食醋中醇类、酯类、酮类、吡嗪类、酚类物质的含量均有明显提升。本研究结果表明,将中村芽孢杆菌应用到固态食醋发酵过程中,可提高出醋率,降低生产成本,并在一定程度上提升食醋的口感,对于提升传统发酵调味品的生产效率及产品品质具有重要意义。