启宫丸治疗多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗痰湿证的临床疗效及网络药理学机制研究

张红阳，莫殿军，陈颖，赵新宇

（1.赤峰学院，内蒙古赤峰 024000；2.赤峰学院附属医院，内蒙古赤峰 024005）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）为女性常见的生殖内分泌与代谢相关联的疾病，影响着我国5.6%的育龄期女性[1]。PCOS 以高雄激素血症（HA）、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰岛素血症（HI）为主要特征，远期可并发2 型糖尿病（T2DM）、心血管疾病、子宫内膜癌、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、代谢相关脂肪性肝病等[2]。流行病学调查显示，50%～ 70%的PCOS女性伴IR，IR不仅是PCOS的临床特征，还被认为是PCOS 发生发展的中心环节[3]，是独立于肥胖的在PCOS 发病机制中起主要作用的危险因素[4]，而且在PCOS 生殖和代谢异常的发生机理中也起着重要作用。

《女科切要》曰：“肥白妇人，经闭而不通者，必是湿痰与脂膜壅塞之故也。”《丹溪心法》记载：“若是肥盛妇人，禀受甚厚，恣于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰。”现代中医学认为，PCOS 的发生以脏腑功能失常，痰瘀互结，阻滞冲任、胞宫、脉道、肌肤而发为PCOS。由此可见，PCOS 与痰湿密切相关。PCOS-IR 的中医体质以痰湿质多见[5]，PCOS 痰湿证与IR 明显相关[6]，PCOS-IR 病机关键在于痰湿阻滞。启宫丸出自《医方集解》，书中注释：“此足太阴厥阴药也，橘半白术，燥湿以除其痰，香附神曲，理气以消其滞，川芎散郁以活其血，则壅者通，塞者启矣，茯苓甘草，亦以去湿和中，助其生气也，肥而不孕，多由痰盛，故以二陈为君，而加气血药也。”全方共奏燥湿化痰、健脾理气活血之功。现代研究[7-8]显示，启宫丸可改善PCOS-IR 状态，但其作用机制不明确。本研究以临床研究为基础，通过挖掘GEO 数据库，结合网络药理学与分子对接技术，探讨启宫丸治疗PCOS-IR 的药效物质基础与分子机制，为临床应用提供依据，并为进一步研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 临床研究

1.1.1 研究对象及分组 选取2020年1月至2022年8月就诊于赤峰学院附属医院，明确诊断为PCOS-IR痰湿证的患者，共60 例。采用随机数字表法将患者随机分为对照组与观察组，每组各30 例。本研究符合赫尔辛基宣言并通过赤峰学院附属医院伦理委员会的审核批准（伦理审批号：fsyy202147），且所有患者均签署了知情同意书。

1.1.2 诊断标准（1）PCOS诊断标准：参照2003年Rotterdam 诊断标准[9]：①稀发排卵和/或无排卵；②临床和/或生化的高雄激素血症；③超声检查结果提示：一侧或双侧卵巢内直径在2～9 mm 的卵泡数≥12个，和/或一侧或双侧卵巢体积≥10 cm3。排除其他引起雄激素增高的疾病，如先天性肾上腺皮质增生、释放雄激素肿瘤和库欣氏综合征等，符合上述3条标准中的任意两条即可诊断。（2）IR 诊断标准：参照2018年中国PCOS诊治内分泌专家共识[10]：①稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（HOMAIR）≥2.69[参照1994年全国糖尿病防治协作组调查库中具有完整口服葡萄糖耐量试验（OGTT）资料的中国人]。（3）中医痰湿证诊断标准：参照国家中医药管理局《多囊卵巢综合征中医诊疗方案脾虚痰湿证证候诊断》[11]：主症：婚久不孕，经行后期、甚或闭经，形体肥胖。次症：带下量多，色白无味；身体倦怠乏力，沉困嗜睡；月经量少，或经色淡黯；胸腹痞满。舌脉：舌淡胖或边有齿痕，苔白或腻；脉滑或沉涩、沉缓。以上主症具备1项，次症具备3 项或以上，即可诊断。

1.1.3 纳入标准 ①年龄为19～40周岁；②符合PCOS 和IR 诊断标准；③符合中医痰湿证诊断标准；④体质量指数（BMI）≥23 kg/m2；⑤自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1.1.4 排除标准 ①具有临床意义的消化系统、呼吸系统、血液系统、泌尿系统和神经系统等严重疾病的患者；②精神病患者；③已明确诊断的糖尿病患者；④未控制的高血压（≥160/100 mmHg）或低血压（收缩压＜95 mmHg）患者；⑤肝肾功能异常患者；⑥近3 个月内应用激素类药物或近1 个月内服用可能会影响检测结果的中药、西药或中成药的患者。

1.1.5 治疗方法 对照组给予盐酸二甲双胍片治疗，用法：盐酸二甲双胍片（北京京丰制药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H11 021518；规格：250 mg/片），饭中口服，第一周，每天2次，每次500 mg；第二周起，每天3次，每次500 mg。观察组在对照组的基础上联合启宫丸汤剂治疗，用法：启宫丸汤剂（由陈皮、半夏、茯苓、白术、香附、川芎、神曲、甘草8味中药组成，由赤峰学院附属医院中药房统一提供和煎制，每剂中药煎取300 mL 并分装为2袋，150 mL/袋），每日2袋，分2 次于早饭前和晚饭后半小时温服。2 组疗程均为12周。

1.1.6 观察指标（1）疗效性评价：观察2组患者治疗前后肥胖指标[体质量、BMI、腰围（WC）、腰臀比（WHR）]，性激素指标[血清雌二醇（E2）、睾酮（T）、性激素结合球蛋白（SHBG）、游离雄激素指数（FAI）]，糖脂代谢指标[空腹葡萄糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、稳态模型胰岛抵抗指数（HOMA-IR）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）]。其中，血清E2、T、SHBG 检测试剂及配套仪器购自罗氏诊断产品（上海）有限公司；FPG检测试剂及配套仪器购自四川迈克生物科技股份有限公司，FINS 检测试剂及配套仪器购自潍坊三维生物工程集团有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C 检测试剂及配套仪器购自日本和光纯药工业株式会社。BMI=体质量（kg）/身高2（m2）；WHR=WC（cm）/HC（cm）；FAI=T（nmol·L-1）×100/SHBG（nmol·L-1）；HOMA-IR=FPG（mmol·L-1）×FINS（μU·mL-1）/22.5。（2）安全性评价：观察2 组患者治疗过程中腹痛、腹泻、皮疹等不良反应发生情况，以及肝功能、肾功能、血常规、尿常规等安全性指标的变化情况。以上生化指标均由赤峰学院附属医院检验中心检测。

1.1.7 统计方法 应用SPSS 25.0统计软件进行临床数据的统计分析。计量资料用均数± 标准差（x±s）表示，若数据符合正态分布，采用t检验分析；若不符合正态分布则采用非参数秩和检验分析。所有检验采用双侧检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 启宫丸药物活性成分与靶点筛选 将启宫丸8味药物输入到以下分析平台中，符合任何一平台的标准即可纳入：（1）中药系统药理学数据库与分析平台数据库（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18；（2）中医药百科全书数据库（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）类药性≥0.49；（3）中国知网、万方、PubMed 等文献数据库查阅到的活性成分。利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对活性成分进行SMILE结构与2D结构查询，将SMILE 结构输入FAFDrugs4 平台（http://fafdrugs4.mti.univ-paris-diderot.fr）进行药代动力学的吸收（A）、分布（D）、代谢（M）和转化（E）信息查询，以结果中“Accepted”为活性成分纳入指标。汇总活性成分，整理去重。在TCMSP 数据库、中药高通量实验和参考数据库（HERB，http://herb.ac.cn/）中查找活性成分的ID。

在TCMSP数据库、ETCM数据库、PubChem数据库及文献数据库中筛选活性成分的对应靶点。将活性成分SMILE结构输入到STITCH数据库（http://stitch.embl.de/），2D结构输入Swiss Target Prediction 平台（http://swisstargetprediction.ch/），通过化学相似性进行靶点预测。整理汇总所有靶点，去重。利用Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/）将所有靶点统一转换为基因靶标。

1.2.2 PCOS-IR 差异基因靶点筛选 在基因表达数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中以“polycystic ovary syndrome”或“PCOS”与“insulin resistance”或“IR”为检索词进行相关基因芯片检索。通过阅读摘要获得基因芯片，以|log2FC |＞2，校正P＜0.05 为标准筛选差异基因靶点，绘制火山图；以前20 个上调与下调基因绘制热图。

1.2.3 药物疾病交集靶点及韦恩（Venn）图 将启宫丸靶点与PCOS-IR 靶点采用Venn 图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，初步获得启宫丸与PCOS-IR的交集靶点。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选 将交集靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/），选择物种为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值＞0.40，获得PPI 网络，并将其导入Cytoscape 3.7.2 软件进行网络拓扑属性分析，根据度值（degree）、中介中心性（BC）、紧密中心性（CC），进一步筛选核心靶点；核心靶点根据基因表达量绘制箱状图。

1.2.5 药物-活性成分-靶点网络构建 将启宫丸8 味药物、对应的活性成分、对应的交集靶点整理于Excel 表格中，导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建药物-活性成分-靶点的可视化网络图，对活性成分进行拓扑属性分析，根据degree，筛选前10 位活性成分。

1.2.6 基因本体（GO）生物功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点输入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov），以物种限定为“Homo sapiens”，作用靶点为“Gene List”，进行GO 生物功能和KEGG 通路富集分析，并在Omicshare 平台（http://www.omicshare.com/tools）可视化，绘制条形图、圈图与网状图。

1.2.7 分子对接验证 将前5 位靶点蛋白名称输入PDB 数据库（http://www.rcsb.org/pdb/）中查找到相应蛋白受体，下载“method”评分最低的PDB ID，保存为pdb 格式文件；将前5 位活性成分在PubChem 数据库获取2D 结构，保存为sdf 格式文件。用SailVina 软件进行分子对接，提取结合能，以结合能＜-5.0 kJ·mol-1作为核心活性成分与核心靶点有效结合的筛选依据。OpenBabel 输出分子对接结果。Pymol 软件对分子对接结果进行去除水和原配体处理，导出结合分子结构，在PLIP 网站（https://projects.biotee.tu-dresclen.de/plip-web/plip/index）确定结合位点，保存为Pymol 格式，在Pymol软件中进行结合位点残基可视化与标记。

2 结果

2.1 启宫丸治疗PCOS-IR的临床研究结果

2.1.1 2 组患者治疗前后相关疗效性指标比较表1 结果显示：治疗前，2 组患者的体质量、BMI、WC、WHR 以及血清E2、T、SHBG、FAI、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，观察组的体质量、BMI、WC、E2、FAI、FINS、HOMA-IR 均较治疗前下降，SHBG、HDL-C 均较治疗前上升，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），而对照组仅体质量、FINS、HOMA-IR 较治疗前下降（P＜0.05）；组间比较，观察组的BMI、E2、FAI、FINS、HOMA-IR的下降幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 2组多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）患者治疗前后相关疗效性指标比较Table 1 Comparison of efficacy relevant indicators between the two groups of patients with polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）before and after treatment （）

表1 2组多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）患者治疗前后相关疗效性指标比较Table 1 Comparison of efficacy relevant indicators between the two groups of patients with polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）before and after treatment （）

注：t1，P1为观察组治疗前后比较；t2，P2为对照组治疗前后比较；t3，P3为治疗后观察组与治疗组比较。①P＜0.05，②P＜0.01，与治疗前比较；③P＜0.05，与对照组治疗后比较

2.1.2 不良反应发生情况 研究过程中，2 组患者均未发现不良反应。

2.2 启宫丸治疗PCOS-IR的作用机制预测

2.2.1 绘制Venn图 基于《中华人民共和国药典》，结合在多个数据库中的筛选，最终获得启宫丸活性成分193个，靶点759个；通过GEO 数据库挖掘，获得芯片GSE34526，包括PCOS-IR 7例，健康对照组3例，应用GEO2R 进行差异基因分析，共获得差异基因靶点1 149个，在线绘制Venn图，获得启宫丸与PCOS-IR 的交集靶点76 个。结果见图1。accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

图1 启宫丸与多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）交集靶点Venn图Figure 1 Venn diagram of the intersected targets of Qigong Pills and polycystic ovary syndrome

2.2.2 药物-活性成分-靶点网络 应用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-活性成分-靶点的可视化网络图，其中，蓝色三角表示启宫丸与PCOS-IR 的交集靶点，正三角表示上调基因靶点，倒三角为下调基因靶点；紫色方形为活性成分，结果见图2。经Cytoscape 3.7.2 中拓扑分析，得出前10 位的活性成分，结果见表2。

图2 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）的药物-活性成分-靶点网络Figure 2 Drugs-active components-target network of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表2 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）的前10位活性成分网络节点参数Table 2 Network parameters of the top 10 active components of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

2.2.3 PPI 网络构建及核心靶点筛选 将交集靶点导入STRING 数据库中，选择物种为“Homo sapiens”，对交集靶点进行PPI 分析，结果见图3；将PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2 软件进行拓扑分析，筛选前10位的核心靶点，结果见表3。

图3 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）的靶点PPI网络图Figure 3 PPI network of targets of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表3 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）的核心靶点网络节点参数Table 3 Network parameters of the core targets of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

2.2.4 GEO 数据库差异基因分析 GEO 数据库挖掘共获得差异基因1 149个，其中上调958个，下调191个，结合GEO 数据库差异基因表达与网络药理学核心靶点分析，将前5位核心基因在火山图中标记，同时依据其表达量绘制箱状图，结果见图4。分别将上调与下调的前20 个基因以热图表现，结果见图5。

图4 差异基因分析火山图与箱状图Figure 4 Volcano plot and box plot for differential gene analysis

图5 差异基因表达热图Figure 5 Heat map of differential gene expression

2.2.5 GO 生物功能与KEGG 通路富集分析 GO生物功能富集分析主要从生物过程（BP）、分子功能（MF）以及细胞组成（CC）进行基因注释。GO 功能富集分析共得到1 550个条目，包括BP 1 226条、CC 139条、MF 185条，以各条目错误发现率（false discovery rate，FDR）较小的前10 条作GO 富集分析条形图，其中条形的长度代表P值，条形长度越长，P值越小；圆点的大小代表该条目上的靶点数，圆点越大，该条目上的靶点数越多。GO 富集分析条形图提示：BP富集在炎症反应、防御应答、对含氧化合物的反应等；MF 富集在与信号受体结合、与转录因子结合、与血红素结合等；CC 富集在三级颗粒、细胞膜上的膜筏、膜微域等。结果见图6。

图6 GO生物功能富集条形图Figure 6 Bar chart of the results of GO biofunctional enrichment analysis

KEGG 通路富集分析共得到134 个条目，选取FDR 值较小的前20 条进行可视化，对前10 条进行KEGG 网络分析，KEGG 通路圈图提示信号通路富集在癌症通路、癌蛋白多糖通路、糖基化终末产物与特异性受体（AGE-RAGE）信号通路等。KEGG富集网络呈现通路与通路之间的关系，其中节点越大表示与相邻通路的连接越多，节点颜色越深表示P值越小。灰色节点表示从KEGG 数据库中补充的相邻通路，实线表示通路与通路之间有关联，虚线表示通路与补充通路的有关联。KEGG 富集网络图提示：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3KAkt）信号通路在KEGG 网络中具有重要的连接作用。结果见图7、图8。

图7 KEGG通路富集圈图Figure 7 Circle map of the results of KEGG pathway enrichment analysis

2.2.6 分子对接 分别取活性成分与核心靶点中的前5 位进行分子对接，PDB ID 分别为PTGS2（3NT1）、ESR1（7ABB）、AR（4OHA）、PPARG（2POB）、HSP90AA1（5LRL），以结合能＜-7 kJ·mol-1的分子对接结果进行可视化并标记结合位点残基。结果见表4、图9。

图9 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）的前5位核心活性成分与核心靶点分子对接可视化图Figure 9 Visualized graph of docking of the top 5 core active components and core target molecules of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）

表4 启宫丸作用于多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOSIR）的前5位核心活性成分与核心靶点分子对接结合能力Table 4 Docking and binding ability of the top 5 core active components and core target molecules of Qigong Pills acting on polycystic ovary syndrome accompanied by insulin resistance（PCOS-IR）（kJ·mol-1）

3 讨论

本研究发现，启宫丸联合二甲双胍治疗后多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（PCOS-IR）患者的疗效性指标有明显的改善，其中体质量、体质量指数（BMI）、腰围（WC）、雌二醇（E2）、游离雄激素指数（FAI）、空腹胰岛素（FINS）、稳态模型胰岛抵抗指数（HOMA-IR）均较治疗前下降，性激素结合球蛋白（SHBG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均较治疗前上升，尤其BMI、E2、FAI、FINS、HOMA-IR水平均显著低于单独应用二甲双胍治疗。既往研究[7，12]结果显示，启宫丸可抑制NF-κB 通路的过度活化，纠正Th17/Treg 失衡，降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）等炎症因子水平，减轻炎症状态，从而改善PCOS-IR 病理状态。陈宇等[8]通过观察发现，启宫丸可以调整卵巢局部胰岛素受体底物2（IRS-2）蛋白表达，提高IRS-2 酪氨酸磷酸化程度，改善PCOS-IR 状态。上述研究结果表明，启宫丸治疗PCOS-IR 的整体效果较好。因此，本研究通过GEO 基因芯片、网络药理学与分子对接技术进一步分析其作用机制。

通过启宫丸药物-活性成分-靶点的拓扑分析，筛选出启宫丸治疗PCOS-IR的前5位药效成分为槲皮素、山柰酚、阿魏酸、没食子酸、金丝桃苷。槲皮素是最常食用的膳食类黄酮之一，亦称为植物雌激素。研究表明，槲皮素具有抗糖尿病的特性。槲皮素可以直接促进AMP 活化蛋白激酶（AMPK）、胰岛素受体底物1（IRS-1）和160 kDa Akt 底物（AS160）磷酸化，增强胰岛素级联反应，激活胰岛素信号通路，同时在胰岛素刺激条件下增加糖原合酶激酶3（GSK3β）[13]，而GSK3β 是参与糖原合成的关键酶，也是本研究中发现治疗PCOS-IR 的核心靶点。此外，槲皮素通过调节STAT3/SOCS3/IRS1 信号通路改善肝脏IR[14]。槲皮素还可以间接改善IR，通过降低血清IL-6、TNF-α等炎症因子的水平，减少对IR 的不良影响，以及抑制颗粒细胞Toll 样受体（TLR）/NF-κB 信号通路，改善卵巢组织的炎症微环境，改善PCOS 大鼠卵巢局部IR[15-16]。山柰酚是一种膳食黄烷醇，具有强大的抗炎特性，而炎症被认为是IR 的基础。Luo C等[17]进行体内研究发现，山柰酚抑制IkB 激酶的磷酸化和NF-κB 途径激活与改善肝脏炎症损伤有关，从而有助于改善IR。山柰酚也可以调节葡萄糖代谢。Alkhalidy H 等[18]的研究发现，以每日50 mg/kg山柰酚喂养肥胖小鼠，可以在未改变体质量、未增加食物消耗的情况下有效控制血糖，这与肝葡萄糖生成减少和改善全身胰岛素敏感性相关。另外，山柰酚是丙酮酸羧化酶（PC）的直接抑制剂，可以降低HepG2 细胞以及从肥胖小鼠肝脏分离的原代肝细胞的PC 活性并抑制糖异生。由此可见，山柰酚可能是一种天然的抗糖尿病化合物，通过抑制葡萄糖生成和改善胰岛素敏感性而发挥治疗作用。阿魏酸是一种广泛存在于植物中的酚类物质，具有抗氧化、抗炎等作用。研究[19]显示，阿魏酸可增加肥胖小鼠骨骼肌和大脑中IRS-1、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）的蛋白表达，从而改善IR。没食子酸是一种植物来源的多酚化合物，是植物界中最丰富的酚酸之一，在动物模型中显示具有抗糖尿病功能[20]。没食子酸可诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG），增强胰岛素的敏感性，而PPARG 正是启宫丸治疗PCOSIR 的核心靶点。另外，没食子酸还可以通过减少细胞凋亡，改善胰岛素分泌[21]。金丝桃苷可以通过抑制活性氧（ROS）的过度产生和线粒体中半胱天冬氨酸蛋白酶的激活，从而促进胰岛素分泌并减少胰腺β 细胞的凋亡，预防糖尿病的发生；同时，金丝桃苷具有缓解小鼠IR 的作用，可通过改善胰岛功能、增加糖酵解和减少糖异生以预防糖尿病[22-23]。

通过PPI拓扑预测分析，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、雄激素受体（AR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、热休克蛋白90AA1（HSP90AA1）为启宫丸治疗PCOS-IR 的主要核心靶点。Ozbayer C 等[24]研究发现，PTGS2 与IR 相关，PTGS2 是一种重要的促炎介质和启动炎症反应的关键酶，而炎症能够负性调节胰岛素分泌，并降低胰岛素敏感性[25]。雌激素被认为是血糖稳态的调节剂，与肥胖、IR和糖尿病的病理生理相关。本研究中，GEO 数据挖掘显示，PCOS-IR 患者的ESR1 下调，临床研究显示，盐酸二甲双胍片联合启宫丸治疗后PCOS-IR患者的E2水平较治疗前下降，并且E2水平明显低于单独应用盐酸二甲双胍片治疗。由此推断，启宫丸可能是通过上调ESR1，从而促进E2 与ESR1结合，故血清中E2 水平下降。另外，ESR 在脂肪细胞中高表达，脂肪细胞中的ESR 激活增加了特异性蛋白1（SP1）的核含量、SP1/ESR 相互作用及SP1 与Slc2a4 基因启动子的结合，导致Slc2a4/GLUT4 表达增加[26]。脂肪生成机制研究表明，AR敲除降低了胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）的表达，而IGFBP 可以调节胰岛素样生长因子（IGF）的生物利用度[27]。本研究中，启宫丸联合二甲双胍治疗后FAI明显下降。由此推测，启宫丸可能可通过降低雄激素水平而改善IR。PPARG 是调节胰岛素敏感性的最重要转录因子之一。许多研究已经证明IR 中PPARG 表达率降低。除此之外，Maladobra-Mazur M 等[28]基于体内和体外研究发现PPARG 在IR 中的表观遗传变化，即组蛋白H3 乙酰化和甲基化程度降低，因此PPARG 及其表观遗传修饰可能是IR 的重要调节机制。HSP90AA1 是真核细胞中表达丰富的热休克蛋白，具有介导炎症反应、稳定和纠正错误折叠的蛋白质的作用，而炎症被认为是导致IR的重要因素[29]。将启宫丸中前5位的核心成分与PCOS-IR的核心靶点进行分子对接，其结合能均＜-5 kJ·mol-1，即均具有较好的结合活性，证实启宫丸治疗PCOS-IR的靶向作用。

进一步进行GO 生物功能富集分析，提示启宫丸主要参与炎症反应过程干预PCOS-IR。KEGG 结果表明，启宫丸治疗PCOS-IR 的信号通路主要涉及癌症途径、癌蛋白多糖通路、糖基化终末产物与特异性受体（AGE-RAGE）信号通路等。PCOS 子宫内膜存在IR，而IR 正是子宫内膜增生甚至癌变的风险因素[30]。PCOS 子宫内膜间质细胞经胰岛素刺激后，PI3K-Akt 通路中关键蛋白p-Akt 过度活化，因此IR 与PI3K-Akt 通路的过度激活可能是子宫内膜增生和子宫内膜癌发生的重要病理基础。AGE-RAGE 信号通路与IR 密切相关。AGEs 与RAGE 结合后，通过炎性反应、氧化应激等导致IR。IR 发生后，高水平血糖会促进体内蛋白质、脂质和DNA 的非酶糖基化，从而形成过多的AGEs，因此，AGE-RAGE 信号通路与IR之间存在恶性循环[31]。KEGG 网络图将单个通路进行连接，直观地表现出通路与通路之间的联系，展现生物体内密不可分的复杂关系网络。分析结果显示，PI3K-Akt 与其他通路连接的紧密度最高，在启宫丸治疗PCOS-IR 的复杂通路网络图中具有重要的连接作用。

IR 是PCOS 生殖、代谢发生异常的核心部分。通过生物信息数据、网络药理学与分子对接分析发现，启宫丸通过多成分、多靶点、多通路治疗PCOS-IR，为临床治疗提供了依据，同时后续应通过实验进行更深入的研究与验证。