心肌成纤维细胞DDR2对整合素β1调控的机制研究

郝春媛 李同华 李 霞 葛兴利 张誉洋

心肌纤维化是众多心血管疾病,如冠心病、心肌梗死、风湿性心脏病、高血压等发展至后期的共同病理改变,是影响心血管疾病预后和心血管疾病病死率的重要原因[1,2]。心肌成纤维细胞是心肌纤维化发生的关键效应器,其在心肌损伤后的心肌改建和心室重塑中起着重要作用[3]。心肌成纤维细胞的表型在心脏发生损伤后发生代偿性改变,从心脏内的结构支持型细胞转变为可以分泌大量生长因子和细胞基质的分泌型细胞,同时其增殖能力明显强化,在增殖过程中,分泌大量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原促进损伤心肌组织进行改建从而形成疤痕修复损害心肌并促进心室重塑[4～6]。表型转变的心肌成纤维细胞在急性心肌损伤的急性修复期度过以后,仍然驻留于损伤部位,继续分泌胶原和生长因子,导致心肌局部的胶原过度蓄积以及继发性纤维化,这种结构性变化可以导致心肌舒缩功能的显著性降低[7]。目前所发现的,对于调控心肌成纤维细胞分泌胶原的重要内分泌因子即是血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)[8]。

成纤维细胞不但自身分泌胶原,也通过相应的胶原受体和间质中的胶原相互作用,从而继发调控成纤维细胞的功能。目前发现的胶原受体包括整合素(integrin),盘状结构域受体(discoid domain receptors,DDRs)、糖蛋白Ⅵ以及白细胞相关免疫球蛋白受体-1[9,10]。这些胶原受体可以接受机械和生物化学信号,通过启动一系列信号转导机制从而调控细胞的黏附、增殖、分化和迁移,同时也维持着基质的稳态。在众多类型胶原受体中,DDRs属于跨膜的酪氨酸激酶受体超家族,其胞外域含有典型的盘状结构模序。目前已经鉴别的共有两类DDRs,包括DDR1和 DDR2。研究表明,DDRs在和胶原结合以后,参与到多种疾病的发生和发展中,包括动脉粥样硬化、炎症、肿瘤以及纤维化过程中[10～14]。DDR2是心肌成纤维细胞表达的主要胶原受体,除此之外心肌成纤维细胞也表达另外一种胶原受体整合素β1[15]。整合素属于跨膜受体家族,是由α和β亚单位组成的二聚体,正常心肌组织中主要表达含β1亚单位的整合素,作为细胞受体介导成纤维细胞和基质间的交流。研究发现,酪氨酸激酶受体和整合素之间存在着协同作用并促进动脉粥样硬化、肿瘤转移以及血管生成,但在心肌成纤维细胞中,DDR2和整合素β1两种受体之间的相互影响效应目前并无相关报道[16]。本研究旨在考察DDR2对于整合素β1的调控作用及其机制。

材料与方法

1.材料:Ang Ⅱ、NaHCO3和HEPES购自美国Sigma-Aldrich公司,DDR2 的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)siRNA、对照siRNA、Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。大鼠DDR2高表达载体和G418购自北京Sino Biologicals科技有限公司。质粒小提和大提试剂盒购自美国Promega公司。Opti-MEM培养基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Gibco公司。DDR2、TGF-β1、细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk1/2)抗体以及PD98059购自美国Cell Signaling Technology公司。整合素β1、Myc和β-actin抗体购自英国Abcam公司。成年雄性Sprague-Dawley大鼠(8～12周)由西安交通大学医学部实验动物中心提供,实验动物使用许可证号:SYXK (陕)2020-005,动物的饲养和处死均遵循西安交通大学医学部伦理学委员会制定的基本动物实验伦理原则进行。

2.心肌成纤维细胞的分离和鉴定:大鼠开胸取心脏,取左心室游离壁组织剪碎,冷PBS清洗4次,加入含0.1%胰酶和0.1%胶原酶的消化液中于37℃摇床振摇(100r/min)消化10min后,吸取收集消化后所得的细胞悬液,再加入新的消化液,重复8次。收集所有细胞悬液,400×g离心5min,加入PBS清洗后再次离心,加入10ml培养基重悬细胞,用70μm细胞滤器过滤后接种至细胞培养皿,在细胞培养箱中差速分离1h,更换Opti-MEM培养基继续培养,培养液含有10% FBS、20mmol/L NaHCO3、5mmol/L HEPES 以及1%青-链霉素,80%融合时传代,取P3代细胞进行鉴定及后续实验。心肌成纤维细胞的鉴定使用免疫组化染色,Ⅷ因子相关抗原染色阴性同时波形蛋白染色阳性。

3.siRNA以及高表达DDR2质粒的转染:siRNA转染步骤严格按照Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine2000 的说明书进行操作,具体步骤:稀释9μl Lipofectamine RNAiMAX到150μl Opti-MEM培养液中,另稀释3μl浓度为10μmol/L浓度的siRNA到150μl Opti-MEM培养液中,然后混合两种稀释液室温放置5min,加入到30mm培养皿里已经80%融合的心肌成纤维细胞培养液中,转染24h后更换新鲜培养液,48h以后收集细胞验证干扰效应。DDR2高表达质粒转染操作步骤与上述步骤类似,心肌成纤维细胞接种于30mm培养皿中,待80%融合后,分别加入2μg DDR2高表达质粒和空载质粒以及Lipofectamine 2000,转染后6h更换新鲜培养液,然后继续培养24h后用800mg/L G418 筛选高表达DDR2的细胞克隆。

4.免疫印迹:细胞在裂解液(50mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA,1mmol/L EGTA,5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100,1%甘油以及1 ×的蛋白酶抑制剂) 中置于冰上裂解1h,15000×g,4℃离心15min,收集上清蛋白液。蛋白液测量浓度后,取40μg 蛋白使用SDS-PAGE 分离,然后把蛋白转移到PVDF 膜上。其后使用5%的脱脂牛奶封闭1h 后,与含有第Ⅰ抗体的5%脱脂牛奶在4℃孵育过夜,PBST 清洗后,再与HRP偶联的第Ⅱ抗体孵育1h。此后加入反应发光液进行信号采集(Immobilon Western Chemiluminescent HRP 底物系统,美国Millipore公司)。实验均重复3次,图像用ImageJ软件进行灰度分析。

结 果

1．AngⅡ通过DDR2调控整合素β1:原代培养的心肌成纤维细胞贴壁生长,呈梭形或狭长的多边形(图1A),笔者选取第3代细胞进行后续实验。心肌损伤时存在着AngⅡ在心肌内表达和分泌上调,AngⅡ继而刺激心肌成纤维细胞表型的转变,分泌大量胶原并促进心肌纤维化[17,18]。鉴于整合素β1 在心肌梗死后和压力超负荷中表达量均上调并促进了胶原的分泌和纤维化,首先检测了AngⅡ是否可以影响心肌成纤维细胞整合素β1的表达[19,20]。为了确认AngⅡ调控整合素β1的最佳浓度和时间,笔者分别进行了AngⅡ的浓度梯度和时间梯度实验,浓度梯度分别选择了0.1、0.5和1.0μmol/L,Western blot法实验显示1.0μmol/L能够获得整合素β1最显著的增强效果。时间梯度笔者选择了6、12和24h,结果发现1.0μmol/L AngⅡ作用12h后整合素β1的表达达到峰值。因此,本实验选择1.0μmol/L AngⅡ作用于细胞12h作为标准刺激因素。结果表明,AngⅡ可以显著性上调心肌成纤维细胞整合素β1的表达(图1中B、D),同时,AngⅡ也可以上调心肌成纤维细胞DDR2的表达(图1D)。为了考察DDR2的表达上调是否介导了AngⅡ增强整合素β1的效应,笔者使用DDR2的siRNA沉默DDR2的表达,实验发现,相比对照性小干扰RNA(control small interference RNA,siCTRL),DDR2siRNA可以显著性降低心肌成纤维细胞DDR2的表达(图1C)。在DDR2基因沉默后心肌成纤维细胞继续接受AngⅡ刺激12h,AngⅡ上调整合素β1的效应被完全阻断(图1中D、E,P<0.05)。本研究结果表明,AngⅡ增强整合素β1的效应是通过上调DDR2而介导。

图1 AngⅡ通过DDR2调控整合素β1A.原代分离的心肌成纤维细胞(×200);B.AngⅡ对心肌成纤维细胞整合素β1表达的影响;C.心肌成纤维细胞中DDR2的RNA干扰;D.心肌成纤维细胞在DDR2干扰的前提下,AngⅡ对整合素β1表达的影响;E. DDR2干扰后WB图像的定量分析。siCTRL:Control siRNA; siDDR2:DDR2siRNA

2.AngⅡ通过DDR2-Erk1/2途径调控整合素β1:实验发现磷酸化的Erk1/2在AngⅡ刺激细胞后显著性上调(图2A),而DDR2的RNAi可以显著性抑制AngⅡ引起的磷酸化Erk1/2的升高效应(图2中A、B,P<0.05),说明AngⅡ-DDR2的信号可以影响下游的细胞内Erk1/2通路。前面的实验已经证实了AngⅡ-DDR2通路可以调控整合素β1的表达水平,为了考察Erk1/2是否在AngⅡ-DDR2调控整合素β1的过程中起介导作用,使用能够完全抑制Erk1/2磷酸化的特异性抑制剂PD98059阻断了Erk1/2分子的信号传递功能,在此基础上用AngⅡ刺激心肌成纤维细胞,结果发现PD98059在完全抑制了Erk1/2磷酸化效应后,也显著性抑制了AngⅡ上调整合素β1的效应(图2中C、D,P<0.05)。实验结果表明了AngⅡ-DDR2信号是通过Erk1/2的传递从而调控心肌成纤维细胞整合素β1的表达水平。

图2 AngⅡ通过DDR2-Erk1/2-TGF-β1途径调控整合素β1A.心肌成纤维细胞在DDR2干扰以后,接受AngⅡ刺激;B.DDR2干扰后Western blot法图像的定量分析和统计;C.心肌成纤维细胞在使用PD98059 处理1h后,接受AngⅡ刺激;D.使用PD98059处理后WB图像的定量分析和统计;E.心肌成纤维细胞在TGF-β1干扰以后,接受AngⅡ刺激;F.TGF-β1干扰以后Western blot法图像的定量分析和统计。Ctrl siR:Control siRNA;DDR siR:DDR2siRNA;TGF-β1siR:TGF-β1siRNA

3.AngⅡ通过DDR2-Erk1/2-TGF-β1途径调控整合素β1:多项研究发现TGF-β1在心肌纤维化的过程中起着重要作用[21,22]。本研究均发现AngⅡ刺激细胞后引起TGF-β1显著升高(图2A),DDR2的siRNA可以抑制AngⅡ引起的TGF-β1的升高(图2中A、B,P<0.05)。当笔者使用Erk1/2的抑制剂时,在削弱AngⅡ-DDR2引起整合素β1的升高效应时,同时还发现TGF-β1的升高效应也被显著性地抑制了(图2中C、D,P<0.05),提示TGF-β1受到AngⅡ-DDR2-Erk1/2信号通路调控。为了探究TGF-β1是否也在AngⅡ-DDR2-Erk1/2调控整合素β1中起着重要作用,笔者使用TGF-β1的RNA干扰沉默了TGF-β1的表达,在此基础上使用AngⅡ刺激心肌成纤维细胞,结果发现TGF-β1的降低显著削弱了AngⅡ-DDR2-Erk1/2信号对于整合素β1的上调效应(图2中E、F,P<0.05)。TGF-β1参与了AngⅡ对于心肌成纤维细胞整合素β1表达的调控。

4.DDR2的高表达通过TGF-β1上调整合素β1:为了进一步验证DDR2的RNA干扰实验,笔者上调了DDR2的表达以观察其对整合素β1的影响。实验使用了携带Myc标签的DDR2高表达载体转染心肌成纤维细胞从而直接上调DDR2的蛋白表达量。与RNA干扰实验结果一致,DDR2的高表达可以显著升高TGF-β1和整合素β1的蛋白表达水平(图3A),同时也升高了p-Erk1/2的水平。当使用TGF-β1的RNA干扰沉默了TGF-β1的表达后,TGF-β1的降低显著削弱了高表达DDR2对于整合素β1的上调效应(图3中B、C,P<0.05)。使用PD98059处理细胞也部分削弱了高表达DDR2对于整合素β1的刺激效应。

图3 高表达DDR2通过TGF-β1显著增加整合素β1的表达A.心肌成纤维细胞高表达携带Myc标签的DDR2;B.高表达DDR2的细胞进行TGF-β1的RNA干扰;C.TGF-β1的RNA干扰后的Western blot法图像分析和统计。DDR2 OE.DDR2过表达;Ctrl siR.Control siRNA;TGF-β1siR.TGF-β1siRNA

讨 论

尽管心力衰竭的预防和治疗已经取得了很大进展,但是心力衰竭还是维持着较高的发生率和病死率[23]。持续的心脏内成纤维细胞的活化以及继发的间质纤维化促进了心力衰竭的发展[3,24]。基于此,抑制心肌纤维化是阻止心力衰竭的发展的重要措施[25]。目前临床上多使用血管紧张素转换酶抑制剂或AngⅡ受体阻断剂如新型药物沙库巴曲缬沙坦,对抗AngⅡ诱发的心肌纤维化和心室重塑,尽管如此,关于血管紧张素Ⅱ促进心肌纤维化的具体分子机制,目前还存在很多未知的问题没有解决。

心肌成纤维细胞分泌的大量胶原除了作为结构性改建的基本成份外,胶原和成纤维细胞之间相互作用的分子机制一直都是值得深入研究的问题。在心肌损伤后继发的纤维化过程中,大量的胶原纤维包绕着成纤维细胞,胶原纤维和成纤维细胞表面的胶原受体相互作用,调控着成纤维细胞的生物学特性,包括其增殖、移行和分泌等多种生物功能,尤其是成纤维细胞分泌胶原的能力对于整个心肌损伤后的改建和重塑起着非常重要的作用。目前发现的主要介导成纤维细胞和胶原相互作用的受体为DDR和黏附分子整合素β1。黏附分子从来就不是单纯介导细胞间的黏附,多种黏附分子的胞内段和信号蛋白相偶联,调控着信号从细胞外向细胞内的传递,影响着细胞的多种生理功能。整合素β1本身通过和黏附分子中免疫球蛋白超家族相结合,通过受体和配体的相互作用,调控着成纤维细胞的生理功能,其中对于胶原分泌的调控起着重要作用。

DDR2是一种酪氨酸激酶受体,以前的研究发现很多类型的酪氨酸激酶受体和整合素受体之间存在着协同作用,通过一系列信号转导调节细胞的行为[16,26,27]。但是心肌成纤维细胞上的DDR2和整合素β1之间是否也存在着相互影响目前知之甚少,本研究发现,DDR2的表达降低可以削弱AngⅡ诱导的整合素β1的表达,显然DDR2对于AngⅡ上调整合素β1的效应存在正向促进的作用。本研究还发现,对于没有AngⅡ刺激的成纤维细胞,单纯的DDR2高表达即能够上调整合素β1的蛋白水平,显示DDR2调控整合素β1是心肌成纤维细胞的一种基本信号转导模式,而并非只存在于AngⅡ刺激的情况下。进一步的实验结果发现,DDR2主要通过 Erk1/2信号,增强AngⅡ刺激后的心肌成纤维细胞的TGF-β1的表达,从而调控整合素β1。本研究表明,AngⅡ以DDR2为介导分子,通过激活Erk1/2-TGF-β1信号通路,调控心肌成纤维细胞中整合素β1的表达。

有研究发现DDR1对于整合素β1具有调控作用,从而影响肿瘤细胞的侵袭和上皮间质转化。而本研究聚焦于DDR2而非DDR1,原因是DDR1主要表达于上皮细胞,而DDR2主要表达于间质类细胞例如心肌成纤维细胞。本研究揭示了DDR2能够调控整合素β1表达的基本模式,阐明了AngⅡ通过DDR2-Erk1/2-TGF-β1调控整合素β1的信号转导通路,为通过寻找新靶点拮抗心肌纤维化提供了重要依据。